杀菌剂开发中的室内生物测定杨晓凡1,吴祥为2,黄德智2,花日茂2(1.安徽工程科技学院,安徽芜湖241000;2.安徽农业大学资源与环境学院,安徽合肥230036)摘要　针对杀菌剂开发中的室内生物测定,探讨了活体和离体的相互关系,生物测定类型的选择问题,同时从多角度阐述了杀菌剂生物测定的创新途径。

关键词　杀菌剂开发;生物测定中图分类号　S482.2 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2006)01-0087-02Summ ary of Bioassay in the P rocess of Discovering and Developing N ew FungicideYANG X iao2fan et al　(Anhui University of T echn ology and Science,W uhu,Anhui241000)Abstract　Bioassay plays an im portant role during the process of discovering and developing new classes of fungicides.In this paper,traditional fungicidal bioassay was summ arized.In addition,the fungicidal bioassay selection and its inn ovation way were als o elab orated as tw o focal points.And the research herein was provided as the useful reference for fungicides discovery in China.K ey w ords　Fungicides;Bioassay 在农用杀菌剂研发过程中,药剂、病原菌和寄主及其相互影响始终是关注的重点,而室内生物测定是联系三者的纽带之一。

杀菌剂在其早期的开发中,无论是初筛还是复筛,都必须不断地对化合物进行生物测定,从而确定研究的效果及下一步的筛选方向。

1　传统的生物测定1.1　活体和离体　在目前杀菌剂的研究、开发中,应用最普遍的是离体(In vitro)和活体(In viv o)两大传统室内生物测定技术。

传统离体生物测定技术,即病原菌脱离寄主(感菌植物等)在人工培养基或无培养基的条件下,直接和药剂接触,观察药剂生物活性大小和类型。

离体生物测定主要有附着法、抑菌圈法、孢子萌发法、最低浓度法、生长速率法和干重法等[1]。

离体条件下反映的仅是供试药剂和病原菌的关系。

所以观察的指标(菌丝生长速率、抑菌圈大小和孢子萌发率等)是供试药剂对病原菌直接毒力的表现。

20世纪60年代,日本理化研究所研究并开发了防治水稻纹枯病及其他真菌性病害的多氧霉素(P oly oxin),它的发现在很大程度上取决于“植株喷洒法”的建立。

自此,活体成为农用杀菌剂研究的传统生物测定技术。

活体生物测定,即在室内控制条件下,于病原菌和活体寄主共存体系中观察药剂生物活性大小和类型。

活体测定法按测试材料主要有器官接种试验、种子杀菌剂药效试验、果实防腐剂生物测定等;按作用方式又可分为先接种后药剂处理的治疗作用试验和先药剂处理后接种的保护作用试验。

活体条件下,环境因素易于控制,主要反映的是特定环境下病原菌、寄主和药剂三者关系,病原菌活性受药剂和寄主生物双重影响,所观察的指标(病斑大小、发病率等)是病原菌、寄主和药剂的综合表现。

1.2　离体和活体的关联及选择　离体反映的是药剂对病原生物的直接毒力大小,活体反映特定环境条件下药剂在活体上的药效大小。

离体生物测定快捷、灵敏、易操作;活体生物测定相对耗力、耗物、周期长,程序复杂。

如果离体和活体所反映的杀菌剂生物活性一致,人们更希望用离体代替活体,基金项目　安徽省高等学校青年教师科研资助计划项目(2005jq1063)。

作者简介　杨晓凡(1978-),男,安徽寿县人,硕士,讲师,从事生物农药研究。

收稿日期　2005208228但事实上,有些杀菌剂应用离体有效,活体测定无效,而有些杀菌剂采用活体有效,离体测定却不表现毒力。

20世纪70年代以前开发的稻瘟病防治药剂如灭瘟素(Blasticidins)、春日霉素(K asugamycin)、异稻瘟净(I BP)、克瘟散(E DDP)等无论离体、活体试验都具有较强的活性。

但70年代后开发的防治药剂如噻菌灵(thiabendaz ole)、三环唑(T ricyclaz ole)、四氯苯酞(Fthalide)、灭瘟唑(S21901)等在离体条件下几乎不表现活性,但是在稻株上却显示极高的防治效果。

所以正确选择生物测定方式在杀菌剂开发中往往具有决定性作用。

(1)作用方式。

药剂不是直接杀死或抑制病原菌,而是提高植物抗病性或诱导植物抗病性,以达到防治病害的目的,应考虑活体生物测定[24]。

(2)作用机理。

如开发黑色素合成抑制剂(M BI)类杀菌剂,这类非杀菌性杀菌剂,由于其不阻碍分生孢子萌发,但抑制附着壁的黑色素的形成而使侵入能力下降,所以研究中应选用活体生物测定;20世纪70年代后开发的作用点单一的内吸性杀菌剂离体表现大都不如活体显著,所以开发内吸性杀菌剂,应以活体测定为主。

(3)药剂开发类型。

日用防腐剂、仓储防霉剂、铲除剂类杀菌剂的生测应优先考虑离体,判断其直接毒力的大小;土壤类杀菌剂的开发,如苯基酰胺类CG A8000应以离体测定为主[5];开发保护性杀菌剂可采用离体抑制孢子萌发测定法。

(4)同一生物测定类型,存在不同的选择方法。

离体测定中,有的抑制孢子萌发,有的抑制菌丝生长或导致异常芽管的形成,抑制菌丝生长的不宜用抑制孢子萌发法测定,如春日霉素只能抑制菌丝蛋白质的合成,不能抑制孢子萌发。

活体测定中要考虑活体对药剂的吸收方式不同,有的要叶面喷洒,有的应考虑土壤处理或营养液处理。

在杀菌剂的开发过程中,对筛选化合物的理化性质及作用机制不明,会给筛选过程中的生测选择带来困难。

对于随机合成筛选,发现活性化合物很大程度上依靠机遇,化合物的活性及作用机制是不可预测的[6],应考虑“活体优先”原则。

从天然产物筛选杀菌活性成分,初筛时活性含量、成分、稳定性等未明,离体测定相对敏感,复筛及下一步的分离纯化过程中应采用活体、离体相结合的方式共同追踪活性物安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.S ci.2006,34(1):87-88 责任编辑　孙红忠　责任校对　孙红忠质,以确保不漏选。

应用类推合成法(Analogue synthesis)筛选杀菌剂,一般很难开发出新型作用机制的化合物,所以生测类型的选择应考虑先导化合物的生物学特性。

生物合理设计(Bio2rational Design)筛选以关键的生理生化作用机制为研究对象,如果需要对传统生测选择,首选离体。

获得性系统抗病性激活剂(Activators of system ic acquired resistance)开发,因其作用机制离不开活体,应运用活体[7～9]。

2　新型生物测定技术及其创新途径2.1　新型测定技术　农药开发费用越来越大,周期越来越长,而开发成功率却越来越低。

第3代杀菌剂的开发聚焦于特异的作用靶标,筛选途径从传统的随机合成和类推合成转向天然源、植物诱导素及生物合理设计。

几丁质合成抑制剂、甾醇合成抑制剂可使病菌产生异常芽管及菌丝,有效霉素可使菌丝密度增加,产生异常分枝,这启示着传统的离体测定指标不适宜。

离体观察指标不断增加且趋向微观化、细胞化和间接化[8,9]。

针对天然产物的研究特点,对微量分离物进行抗菌活性跟踪,李树正等开发出灵敏、准确的“对峙培养法”[10]。

周青春等改进了“溴化四氮比色法”,提出了可在新杀菌剂研究筛选及生物学基础研究中应用的微量快速筛选方法[10]。

直接薄层析生物自动显影测定(Direct T LC bioautography detection),集筛选、分离和测定于一体,所需样品量较少,同时灵敏、快捷、可靠,特别适合植物源杀菌剂活性物质的筛选和追踪[11,12]。

组织培养筛选方法适合现代化大规模筛选,同时与大田试验相关度高,其在杀菌剂的生物测定上的应用前景广阔。

如针对细菌性白菜软腐病的“萝卜块根法”,适用于稻瘟病的“剥离叶鞘法”,适用于多种病害筛选的“洋葱鳞片表皮法”,适用于病毒筛选的“局部发病法”和“叶面漂浮法”等,上海市农药研究所成功地应用了组织筛选法,发现了井冈霉素和变构霉素[9]。

高通量筛选(H igh throughput screening,HTS)是20世纪80年代后期发展起来的一种用于寻找医学新药物的高新技术,国外许多农药公司将这种技术用于新农药的筛选。

高通量筛选技术是在传统筛选技术的基础上,应用生物化学、分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术,使筛选样品微量化(样品用量在几微升到几百微升或者微克至毫克级),样品加样、活性检测乃至数据处理高度自动化,使筛选具有快速、灵敏、特异性高等特点[13,14]。

2.2　生物测定技术创新途径2.2.1　药理学途径。

目前,国内外从药理学途径开发的新型生物测定技术有:筛选细胞分裂抑制剂的芽管隔膜法,筛选几丁质抑制剂的异常芽管法,筛选黑色素抑制剂的异常菌丝法等。

它们是根据一些已开发药剂的作用机理而开发的杀菌剂生物测定技术。

生物测定技术为筛选新型杀菌剂服务,反过来,新型杀菌剂的发现及其作用机制研究又推动了杀菌剂生物测定的改进和创新。

2.2.2　植物病理学途径。

通过研究病原菌与寄主之间的关系来研究致病菌或抗病过程,从而开发新型杀菌剂生物测定技术。

植物病原菌致病性研究发现,除了“侵入力”外,病毒素是许多病原的致病因子,针对上述的致病机理,开发以中和毒素或抑制毒素为目标的生物测定技术,开发新型杀菌剂。

如用于玉米小斑病毒素的生物测定方法达40种之多,用离体玉米根冠细胞对H MT毒素进行生物测定等。

有些病原菌能产生抑制寄主防御反应的物质Suppress or,这也是一种致病因素,因此开发抑制Suppress or的生物合成或钝化Sup2 press or的新作用机制杀菌剂,离不开对Suppress or进行生物测定。

噻菌灵的作用机理之一就是诱导水稻产生3种植物防卫素,虽然噻菌灵是以常规方法开发的杀菌剂,但是它给人以启示开发针对“防卫素”的生物测定技术,这对开发“诱导抗病性”杀菌剂无疑具有重大意义。

2.2.3　生物化学和分子生物学途径。

无论是从药理学还是病理学途径,植物病原菌、寄主和药剂三者之间的关系除了少数物理作用外,大多数可从生物化学(酶、激素、免疫系统、电子传递链等)、分子生物学(酶、膜等受体的结构和农药分子在靶标部位作用机理)水平给予最终的解释[9]。