2010级发酵大实验（1）实验报告任课老师：姓名：专业：生物技术班级：学号：日期：2013年6月实验报告一、目的要求：了解筛菌的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，涂板，摇菌，紫外分光光度计的使用等。
二、实验材料1、菌种来源：英语公园葡萄树下土壤和生物学院院楼门口土样。
2、培养基：（1）淀粉液体培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5%（2）淀粉固体培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉1.5% 。
3、器皿：试管，量筒，烧杯，移液管，培养皿，洗耳球，玻璃棒，酒精灯，接菌环，三角瓶，玻璃棒等。
4、仪器：高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，恒温培养箱，摇床，天平、紫外可见分光光度计等。
5、试剂：1%碘液、1M NaOH、DNS、pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液、1%淀粉溶液、1mg/mL的麦芽糖，结晶紫溶液。
6、其他：封口膜、纱布，棉花，试管架等。
三、实验步骤：1、初筛：（1）配制培养基：按照上述培养基成分及数量称取各物质，放入三角瓶中，加水到100ml，包扎。
和包扎好的试管、移液管、涂布器、培养皿等一起放入灭菌锅中121℃高压灭菌20min。
然后干燥后使用。
（2）倒平板：把培养基置于无菌工作台上，待冷却到55℃左右后，倒入灭菌后的平板中，每个平板中约15-20ml，之后待冷却凝固。
（3）菌悬液制备：我们组分别从英语公园的葡萄树下和生物学院院楼门口采集土样，各称取10g，放入装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡20min后静置5min。
（4）浓度稀释：在无菌试验台上进行浓度梯度稀释,把土样摇匀，从中吸取1ml 置于事先灭好菌的试管中，再加入9 ml无菌水，再从该试管中吸取1ml土样置于另一只无菌试管中，加入9ml无菌水，依次稀释到10^-5、10^-6、10^-7、10^-8待用。
（5）涂布平板：在超净工作台中，分别在10^-5、10^-6、10^-7、10^-8浓度下各取1 ml两种土壤稀释液倒入已冷却的平板中（因有一根试管破裂所以第二组土壤缺少10^-7浓度的稀释液，不过不影响之后的实验）。
用涂布器涂布均匀，在平板上标注土样的浓度。
把标注好的培养皿放入37 ℃培养箱中培养16-18h 。
（6）加碘筛选：取出培养好的平皿，放入冰箱中培养24h，取出后在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。
2、复筛：平板划线：用上述配制培养基和到平板的方法再制得培养基，用灭过菌的接菌环从上述培养皿中挑去菌落周围透明圈和菌落直径比值较大的菌落在新配置的培养基上进行划线分离，之后进行浓度标注。
将标注好的培养皿放入37 ℃培养箱中培养16-18h。
3、检测菌种淀粉酶酶活：（1）配培养基：配置上述液体培养基，分装到多个100ml锥形瓶中，灭菌。
（2）接种：再次滴加碘液，挑选得到的周围透明圈较大的菌落，刮取1环接种至灭菌的含30/25mL液体培养基的三角瓶中。
并做好标记，方便后续菌种的保存接种后的培养基至于摇床中培养，培养条件为：30℃，180r/min、6小时后即可。
（3）测麦芽糖标准曲线：1）浓度为1mg/mL的麦芽糖标准液的配制：准确称取50mg麦芽糖于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至50mL，充分混匀。
待用。
2）取8支洗净烘干的10mL具塞刻度试管，编号后按表2加入标准麦芽糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的麦芽糖溶液。
充分摇匀后，向各试管中加入2.0 mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至10mL，充分混匀。
在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。
以麦芽糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，绘制出麦芽糖标准曲线。
表1 麦芽糖标准曲线制作（4）测菌液浓度（比浊法）：以参比液为空白对照，测定待测液OD590nm处的吸光值，以OD值标示枯草芽孢杆菌的生物量。
OD值最好等于1.（5）稀释菌液：通常用去灭菌去离子水稀释稀释到50-200倍，但因为我们组的菌液测浓度较低，故并没有进行稀释直接用的原液。
（6）、淀粉酶活力的测定：1）取10mL刻度试管2支（标记为A、B），分别加入0.5mL已稀释的待测酶液。
2）在B管中加入0.5mL 1M NaOH灭酶活，A管中加入0.5 mL pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液。
然后在两管同时加入0.5 mL 1％淀粉溶液作为反应底物。
3）40℃恒温水浴锅准确反应5 min4）A管加入0.5 mL 1M NaOH灭酶活，B管中加0.5 mL pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液。
两管加显色剂DNS试剂2.0 mL，沸水反应5 min，反应后迅速冷却定容至10mL。
5）用分光光度计再540nm处比色，用B管作为对照，测定OD540nm值。
6）根据麦芽糖标准曲线计算麦芽糖含量（G）和发酵液中酶活力。
酶活力定义：40℃，每分钟催化可溶性淀粉水解生成1 mg麦芽糖所需要的酶量为一个活力单位（U）计算公式：酶活力＝y/生物量OD值/5×20×菌液稀释倍数可得（7）结果分析:若发酵液酶活性＜0.1U，基本可视为杂菌污染。
四、实验结果：1、初筛结果：图1.梯度10-5的土壤菌种初筛结果图2.梯度10-6的土壤菌种初筛结果图3.梯度10-7的土壤菌种初筛结果图3.梯度10-8的土壤菌种初筛结果2、初筛加碘液结果：图1.梯度10-8的土壤菌种结果图2.梯度10-8的土壤菌种结果注：因为其他梯度出现的透明圈几乎可以忽略，只有10-8出现了很明显很大的透明圈，故我们组主要进行这个梯度的后续实验，故其他梯度的结果忽略不计，故未照相。
3、复筛结果：图1.梯度10-8的土壤菌种复筛结果经过平板划线，只有梯度为10-8只有的菌种分离了，其他梯度的菌种仍是以线性存在，可惜的是我们组当时没有想到要照相，只留了10-8这个梯度的结果，加完碘液后仍然具有很大的透明圈，这个菌很有可能就是我们的目的菌。
4、麦芽糖标准曲线：表2 麦芽糖标准曲线管号1 2 3 4 5 6 7 8试剂麦芽糖标液（mL）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4蒸馏水（mL）2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6麦芽糖含量（mg）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.40 0.210 0.511 0.999 1.381 1.815 2.026 2.249OD540可得标准曲线为：y=0.0564x+0.0048，其中y为麦芽糖含量，x为OD值。
5、菌浓度的测定：表3 菌浓度测定编号菌种梯度OD值1 0.000 0.0002 10-70.0563 10-8（1）0.1914 10-8（2） 1.5776、酶活测定实验：表4 酶活测定实验编号菌种梯度OD值1 10-70.0222 10-8（1）0.0113 10-8（2）0.0947、计算麦芽糖含量根据麦芽糖标准曲线，计算所得麦芽糖含量。
表5 麦芽糖含量编号梯度OD值x 麦芽糖含量y1 10^-7 0.022 0.00602 10^-8（1）0.011 0.00543 10^-8（2）0.094 0.01018、计算酶活表6 酶活计算编号梯度麦芽糖含量y 酶活(U/mL)1 10^-7 0.0060 0.42862 10^-8(1) 0.0054 0.11313 10^-8(2) 0.0101 0.0256五、结果分析：本实验的设计方案具有一定的理论依据，如果操作得当，各方面条件满足，会得到产淀粉酶的活性芽孢杆菌高产菌株，及该菌株的最佳摇瓶发酵条件。
但操作过程存在很多缺陷，导致结果失败，主要问题有：1、分离芽孢杆菌时，稀释度不够导致水解圈粘连；2、DNS法测OD值时，一部分数据显著偏大，可能是稀释倍数不够所致；3、DNS法测OD值时，由于操作失误，忘记每个试管做平行测量，造成结果不精确；4、取样过于随意，所取土壤中含酶活的细菌不多；5、无菌操作不是很标准，可能造成染菌。
6、富集培养时未除去土壤。
效果同加入过多的葡萄糖一样，土壤中有一部分营养物质，致使长过多的杂菌，实验时应该出去土壤，但是当时又怕细菌都吸附在土壤颗粒上，除去土壤的同时会除去细菌。
应该注意大胆尝试，做一组试试看，说不定结果会很好。
7、培养基中加入葡萄量可能颇多，导致细菌利用较多利用葡萄糖，产生的淀粉水解圈不明显。
培养基中加入葡萄糖，原因是芽孢萌发时加葡萄糖以利生长，但是可能是当时加入葡萄糖的量偏多，使不能利用淀粉的细菌芽孢也萌发，致使有较多杂菌不利于检验，同时又使可利用淀粉的细菌芽胞萌发成营养细胞后利用葡萄糖，而不是利用淀粉，致使产生的淀粉水解圈太小。
下次实验时应注意仔细查阅资料及询问老师，控制好加入的营养物质的量。
六、个人心得：在自然界的土壤中存在能产生淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土样悬液、杀死非芽孢细菌、平板分离可获得疑似芽胞杆菌的单菌落，将单菌落点接含有淀粉的平板，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围也会出现水解圈，但肉眼不易分辨，用碘液染色法染色后显现出透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。
由此可将产淀粉酶能力的菌株分离。
透明圈与菌落直径比值的大小在一定程度上反映了菌落纯度和产淀粉酶的活力菌株产生淀粉酶的能力：前者与后者的比值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉的能力也就越强。
土壤中存在产淀粉酶的细菌，然而，土壤中存在的产淀粉酶的细菌在整个土壤细菌中所占的比例是较小的，土壤中绝大多数的细菌是不能产生淀粉酶的。
高温对于土壤中的不耐热的细菌具好的消灭效果，却对产淀粉酶的细菌没有影响。
所以，可以通过高温处理来提高分离出来的产淀粉酶细菌的纯度。
由于受实验设备及实验操作等方面的影响，经初步筛选出的含淀粉酶细菌中仍混有其它杂菌。
所以，我们应该对初步筛选出的细菌再次进行筛选，筛选出纯度较高的含淀粉内细菌，并用显微镜观察其菌落的特征，对照辨别其所属菌种。
针对该菌种的特性，对其淀粉酶的活性、生长周期、最适温度、最适PH、耐酸性、耐碱性、发酵条件等一系列问题进行深入的研究，探究其在工业生产以及其他领域的中的应用。
通过亲自体验本次试验，能够真正了解到微生物发酵的过程，将课本上的东西都结合到实验来，并且对一些不理解的器具也有了充分的认识，包括对发酵罐各个部件的，各个管路的认识以及他们的作用。
在操作过程中我们要严格自己的操作,实验测量的数据要保持真实性。