免疫组化实验步骤 Revised final draft November 26, 2020
石蜡切片免疫组化实验步骤
石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）：
1）材料的准备
在本实验室条件下推荐使用FAA（50%ethanol,5%aceticacid,3.7%甲醛）固定材料。

FAA固定液（100ml），室温保存：
无水乙醇50ml
冰醋酸5ml
37%甲醛10ml
水35ml
第一天：组织固定
用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。

第二天：脱水
以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。

*组织可在70%ethanol4℃可存放几个月
第三天：进一步脱水和浸蜡
以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇
以下所有步骤在室温进行并不时轻摇
准备工作：60℃预热plus蜡片（ParaplastPlus）石蜡可反复融凝而去气泡
第四天：浸蜡2
将材料置于42℃直至蜡块完全熔化。

再加1/4体积的蜡块至完全熔化后移至60℃。

几个小时后换上新鲜熔好的蜡液，过夜。

第五天：浸蜡3
换蜡两次（ParaplastPlus）
第六天：浸蜡4
换蜡两次（ParaplastPlus）
第七天：浸蜡5
换蜡两次（ParaplastPlus）
准备工作：60℃预热Regular蜡片（ParaplastRegular）
第八天：包埋（包埋块可长久保存）
第九天及之后：
开始切片，切片应包括自己的片子及正负对照等。

事先打开烘片机至37度，在涂有多聚赖氨酸的玻片上加1~2ml的蒸馏水。

切好的片子轻至于加水的玻片上。

待所有片子准备完之后盖上盖子，烘片过夜。

用自来水及双蒸水清洗免疫组化专用塑料，放在烘箱烘干待用。

第二天：开始脱蜡（From徐晓峰、朱老师整理的“石蜡切片”protocol）
（用新买来的免疫组化塑料小盒，每一步只需加入试剂220~250毫升）
抗原修复：
在切片还浸入酒精时，可以事先将煮锅清洗干净，用蒸馏水洗1~2遍，最后加入0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，将过完PBS的片子让入煮沸的锅中，煮片10~15min。

然后将电磁炉关闭，自然冷却锅中切片（千万不要把片子拿出来，放在缓冲液中一起自然冷却至室温！！！）
将片子浸入PBS（PH=7.4）5min。

重复一遍。

封闭：
在抗原修复时可以事先配制封闭液，用PBS（PH=7.4）配制3%BSA的封闭液。

将PBS中的切片放入封闭液中，室温放置30分钟~1小时。

杂一抗：
在封闭时可先剪好与切片大小相当的封口膜，并准备加有少量水的塑料大盒，用卫生纸垫在塑料大盒中附带的塑料板上。

用封闭液稀释一抗(GFP兔多抗以1:100稀释，其它一抗需要另外尝试)。

将稀释完的一抗加在片子上，每张片子保证不少于100ul，用封口膜封上，检查是否有汽泡，轻轻赶走气泡。

将片子放在塑料大盒
中，盖上塑料盖子，放入冰库过夜。

杂二抗：
事先配制好TBS(PH=7.4)缓冲液，用TBS（PH=7.4）缓冲液稀释带有碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔二抗，比例为1:200。

将塑料大盒从冰库中拿出，浸入TBS（PH=7.4）
缓冲液中洗一抗，5min，重复3次，在洗一抗的过程中准备封口膜。

将片子上的残余缓冲液倒去（但片子必须保持湿润！！！）每张片子加不少于100ul的二抗稀释液，盖上封口膜，放入塑料大盒中，室温放置1~1.5小时。

洗二抗并显色
用TBS(PH=7.4)缓冲液洗二抗，5min,重复3次。

同时在暗处配制显色液（40ul溶
液A+40ul溶液B+720ul水，可根据实际切片数量按比例配制显色液），剪切封口膜。

将片子至于暗处，倒去缓冲液，每张片子加不少于100ul的显色液，轻轻盖上封口膜，放于暗处进行显色。

每隔15分钟左右看一下片子是否开始显色(根据经验，加入显色液30min~1小时会开始显色,但是需要根据不同蛋白表达强弱，把握显色
时间)。

发现显色之后需加蒸馏水终止反应，再盖上盖玻片进行观察并拍照。

试剂：
1.0.01MPBS（PH=7.4）:
购买的小包装粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后调PH值至7.4。

2.TBS:
2.4gTris,8.8gNaCl溶于1L水中，调PH值至7.4
3.0.01M柠檬酸钠缓冲液(PH=6.0)：
2.94g柠檬酸三钠2H2O溶于1L蒸馏水中，用固体柠檬酸调PH至6.0
4.3%BSA封闭液
7.5gBSA溶于250毫升PBS(PH=7.4)中。