生化试验技术绪论1．生物体内某一组份，大致可分为五个基本阶段：(1)确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法。
(2)制备物物理化学性质稳定性的预备试验。
(3)材料处理及抽提方法的选择。
(4)分离纯化方法的摸索。
(5)获得制备物以后，均一性的测定。
212(1)呈色法；(2)色谱法；(3)光谱法；(4)电泳法；(5)核磁共振波谱法。
(6)其他:如电子显微镜观察。
理化测定方法的最大优点是实验操作简便快速，能及时指导分离制备工作。
33．好的分析鉴定方法必须满足以下要求:1）特异性和专一性强；2）重现性好；3）准确度大；4）灵敏度高；5）手续简便。
4．制备物的理化性质及稳定性的预试验是对一个未知物质分离制备实验设计的基础。
5．材料的处理：1）选材：（1）工业生产：材料来源丰富、含量高、成本低；（2）未知物质：只要达到实验目的即可。
2）预处理：保证材料的纯净；3）组织破碎方法：（1）机械法：组织捣碎机，匀浆器，研钵和研磨、压榨机（2）物理法：(1)反复冻融法(2)急热骤冷法： (3)超声波处理（3）化学及生物化学法：(1)自溶法(2)酶解法(3)表面活性剂处理⑷溶胀法6．使生物活性物质保持活性，主要措施常有如下几点：1）采用缓冲液。
2）加入保护剂。
3）抑制水解酶的破坏4）一些特殊的措施：引起生物大分子变性的因素，如紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等均应避免，有的还要求提取时无氧等。
第一章1．蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？1）溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法； 2）分配系数不同：如分配层析法3）吸附性不同：如吸附层析法； 4）在电场中运动速度不同：如电泳法5）沉降系数或密度不同：如离心法；6）分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法；7）生物学特性不同：如亲和层析法；2．蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项？蛋白质的分离提取的一般步骤为：一般来说，蛋白质的制备包括以下过程：(1)材料的选择和预处理；(2)破碎生物组织(原料是细胞外分泌物时无需此步)，并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来；⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒如核．线粒体．微粒体或核糖体及细胞碎片与溶液分开；(4)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；(5)进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开；(6)根据具体产品要求，在适当条件下将蛋白质形成结晶或制成冻干粉。
注意事项：(1)(2)(3)(4))、金属螯合剂(如EDTA)。
要避免一切3．举例说明沉淀分离蛋白质的方法。
（1）盐析法；（2）有机溶剂沉淀法；（3）有机聚合物沉淀法（4）选择性变性沉淀法；（5）等电点沉淀法；（6）生成盐类复合物沉淀法4．蛋白质含量测定的方法有哪几种?原理如何?1）双缩脲法原理：铜离子与蛋白质的肽键结合，形成紫红色络合物，此物质在540nm处有最大吸收，2）Folin—酚试剂法(Lowry法)原理是在碱性条件下，蛋白质与碱性铜溶液中的铜络合使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应，产生深蓝色，其颜色的深浅与蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量呈正比，由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，故在测定时需使用同种蛋白质作标准。
3）紫外吸收法测定蛋白质含量是利用物质在紫外光区（200～400nm）特有的吸收光谱来鉴定物质性质及测定含量的方法。
（1）280nm紫外吸收法；（2）280nm和260nm处的吸收差法（3）215nm和225nm的吸收差法4）考马斯亮蓝染色法（Brodford法）蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G—250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色由棕红色变为蓝色），从5）凯氏定氮法被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和硫酸结合生成硫酸铵。
硫酸铵在强碱作用下分解产生氨。
用水蒸气蒸馏法将氨收集于过量的硼酸中，然后用标准酸溶液滴定。
根据所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约为6.25％，计算样品的蛋白质含量。
5．蛋白质纯度鉴定的方法有哪几种？1）电泳法； 2）通过层析性质的检测； 3）免疫化学法4）蛋白质化学结构分析法； 5）超速离心沉降分析法； 6）其它方法6．蛋白质结晶的方法有哪几种？盐析法、有机溶剂法、等电点结晶、温差结晶、脱盐结晶、金属离子7．蛋白质干燥的方法有哪几种？常压吸收干燥、真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、滚筒干燥红外线干燥、微波干燥、高压静电干燥8．某学生分离提取得到某一个酶，测定其活性发现没有活性，分析其可能原因。
1）在操作上没有达到快速、低温、加入蛋白酶抑制剂、尽量避免过度接触氧气的要求、未加入巯基试剂、加入一定的化学试剂（甘油、镁离子)、金属螯合剂(如EDTA)。
2）有过激因素（如过酸或过碱）的影响。
如未选择缓冲液的pH和缓冲容量。
在操作过程中未尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高水平。
3）最后值得提醒的是，提纯过程中即使很小心，蛋白质结构也要发生一定的变化，因此，提纯后的蛋白质，即使其活力基本上得以保留，它的构象也有可能不同于天然构象或完整功能的构象，有可能酶因此失去活性。
9.向一蛋白质溶液中加入有机溶剂，该蛋白沉淀下来，该蛋白的活性是否受到影响？为什么？答:蛋白质活性会受影响，使用有机溶剂沉淀法可能是蛋白质变性，若蛋白质变性则蛋白质活性必然会受到影响，但是如果实验条件控制合理，实验始终在较低温度下进行，可以防止蛋白质变性。
10.一个蛋白质的提取物，SDS-PAGE后发现有多条带，试分析可能原因。
1)SDS-PAGE具有变性的作用，可以使蛋白质变性，一个蛋白质可能有好多亚基，变形后亚基之间不再有二硫键等一些连接，即互相脱离了，所以你跑出的带可能是这个蛋白质的不同的亚基。
2)电泳的蛋白质不可能是纯粹一种，蛋白质提取的不纯也会有很多带的12.欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75％，需加入饱和硫酸铵多少？13.某一蛋白经SDS-PAGE后在标准蛋白的13000～36000D间出现了一条带，加入巯基乙醇和碘乙酸处理后，发现SDS-PAGE后仍然为一条带，且带的位置在13100D处，试推断一下该蛋白的可能结构。
第二章1．凝胶过滤层析技术的原理。
层析技术是利用混合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等），使各组分在两个相中的分布不同，其中一相是固定不动的（固定相），另一相是流过这个固定相的液体或气体（流动相），从而使各组分以不同速度随流动相向前流动而达到分离的目的。
2．离子交换层析的原理及缓冲液如何选择？原理：离子交换层折是根据被分离物电荷来分离分子的一种层析技。
离子交换剂是通过化学反应（酯化、醚化或氧化）将解离基团引入到随性支持物上形成的。
能结合与解离基团带不同电荷的离子。
蛋白质带负电，可结合在阴离子交换剂上；带正电，可结合在阳离子交换剂上，蛋白质电荷密度越大，结合越牢，在柱中移动速度越慢。
因此，各种蛋白质分子所带电荷量不同，它们对交换剂的亲和力就有差异。
带电蛋白质分子与交换剂的结合是可逆的。
一般用pH梯度和盐浓度梯度溶液把吸附的蛋白质从柱上洗脱下来。
分离效果与交换剂颗粒的大小、柱长度、洗脱剂浓度和pH等。
3．分子筛层析（凝胶过滤层析）的原理与技术。
原理：主要根据分子大小不同来分离蛋白质及测定其分子量。
实验技术：1）凝胶的选择：混合物的分离程度主要取决于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物分子量的分布范围，主要对凝胶的交联度、颗粒粗细进行选择。
2）凝胶的处理：干燥的颗粒，使用前必须充分溶涨、浮选。
3）装柱：润洗。
检查装柱的质量，最简单的方法是用肉眼观察色谱床是否均匀，有没有“纹路”和气泡。
4）加样样品上样量主要取决于样品体积，而样品浓度对结果的影响很小。
另外，胶型号也决定了上样量。
凝保持色谱床表面的稳定。
可用人工方法。
5）洗脱非水溶性物质的洗脱都采用有机溶剂，(如苯和丙酮等)。
水溶性物质的洗脱一般采用水或缓冲液6）收集：一般使用分部收集器收集洗脱液。
洗脱时控制流速至关重要，常采用恒流泵。
7)样品洗脱峰的检测;8)凝胶的再生和干燥;凝胶过滤层析的应用1)脱盐；2)蛋白质的分离纯化； 3) 浓缩； 4)测定分子量4．亲和层析的原理。
亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。
同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。
亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
5．吸附层析的原理。
吸附是表面的一个重要性质之一，任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面的密集现象称为吸附。
能够将其它物质聚集在自己表面上的物质，都称为吸附剂；层析过程就是不断地形成平衡与不平衡、吸附与解吸的矛盾统一的过程。
同一吸附剂对不同物质吸附力不同，对同一物质的吸附力也会因条件的改变而改变。
6．用分子筛法测定分子量与SDS－PAGE测定分子量在原理和方法上有何不同？7．以含有肽聚糖为载体的填料分离溶菌酶属亲和层析还是吸附层析，理由何在？答：由于肽聚糖和溶菌酶的结合时特异性结合，因此属于亲和层析。
8．凝胶过滤层析分离蛋白质时的洗脱行为可用什么来表示？是如何表示的，范围一般在多少？答：被分离物在分子筛中分离时有两个表示洗脱行为的特征常数：一个分配系数；一个分辨率。
1）分配系数Kd=(Vc－V0)/V i （Vc洗脱体积）当Kd＝0时，Vc＝V0，即溶质分子完全不能进入凝胶颗粒内部，完全被排阻于凝胶颗粒维孔之外而最先洗脱下来。
当Kd＝1时，Vc＝V0＋Vi，即溶质分子完全向凝胶颗粒扩散，在洗脱过程中最后流出柱外，通常被分离物洗脱顺序按0＜Kd＜1。
2）另一个特征常数是分辨率，用ρ表示。
ρ＝2（V2-V1）W1+W2V1、V2为两个物质的洗脱体积；W1、W2为两个物质的洗脱峰的宽度。
两个物质要想完全分离，必须ρ≥1。
9．凝胶过滤层析的分辨率如何表示？要想使几个组分分开，分辨率应为多少？答：另一个特征常数是分辨率，用ρ表示。
两个物质要想完全分离，必须ρ≥1。
影响因素:洗脱物的洗脱体积、洗脱物的半峰宽第三章1.电泳：在溶液中带电荷的离子，在一定电场强度下可以移动的现象。
2.迁移率：带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基本原理及缓冲液的选择方法。
答：1）原理聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，联剂）为材料，在催化剂作用下，聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之聚合时由单体丙烯酰胺聚合合成链状物，由交联剂甲叉丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体不溶于水的凝胶。
大小相同。
7.不连续系统：是槽中与凝胶中的缓冲系统pH值、离子浓度是不同或整个胶面的孔径大小不同。