代表碱基
代表磷酸基
第九章核酸类药物分析
核苷酸 磷 酸
碱 基
戊糖
第九章核酸类药物分析
O
NH
碱基 N
N
N
HN
NO
N
H
H
酯键 O
OH
H2O
磷酸 O P O H O H C H 2
O
糖苷键
O
H2O
OH OH
戊糖
第九章核酸类药物分析
核苷酸
酯键Leabharlann 5`碱基连接（糖苷键）4`
1`
3` 2`
第九章核酸类药物分析
（对DNA为H）
第九章 核酸类药物的分析
第九章核酸类药物分析
基本要求
✓掌握：核酸的结构和分类；嘌呤类药物 和嘧啶类药物鉴别、检查、含量测定的 原理
✓熟悉：核酸的理化性质；反义寡核苷酸 药物鉴别、检查、含量测定的原理
第九章核酸类药物分析
第一节 概述
✓结构和分类 ✓理化性质
第九章核酸类药物分析
什么是核酸？
➢ 1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核， 当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何 一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。
第九章核酸类药物分析
第二节 嘌呤类核苷酸药物分析
嘌呤碱（腺嘌呤、鸟嘌呤） 戊糖 磷酸
第九章核酸类药物分析
一、鉴别
➢ 戊糖鉴别 ➢ 嘌呤鉴别 ➢ 磷酸鉴别 ➢ 特征吸收光谱 ➢ 熔点测定
第九章核酸类药物分析
（一）戊糖的鉴别
✓ 苔黑酚反应（地衣酚反应）---凡核糖均有此反应
试剂：浓盐酸，苔黑酚试剂，三氯化铁（催化剂） 现象：鲜绿色
第九章核酸类药物分析
第九章核酸类药物分析
➢ 2.复性
一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活
性的现象；通常使用热复性。（退火）
缓
慢
冷
高温变性
却
热复性
急 速 冷 却 热复性在基因测序中被第广九章泛核应酸类用药物分析
复性失败
第九章核酸类药物分析
➢ （五）颜色反应
✓ 苔黑酚反应:
脱水
Fe3+
腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸
腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 胸腺嘧啶（T)
脱氧核糖
磷酸
RNA
核糖核苷酸
腺嘌呤核苷酸 鸟嘌呤核苷酸 胞嘧啶核苷酸 尿嘧啶核苷酸
腺嘌呤（A) 鸟嘌呤（G) 胞嘧啶（C) 尿嘧啶（U）
核糖
磷酸
第九章核酸类药物分析
稀有碱基
的氢键断裂和碱基堆积力破坏，有规律的双螺旋 结构变成单链无规律的“线团”，但不发生共价 键的断裂，这过程称之。 ✓ 变性原因：高温（一般＞75℃）、强氧化剂、强 酸、碱、尿素等； ✓ 机理：双链间氢键断开，成为两条单链（ DNA双 螺旋二级结构的破坏，生物活性的丧失） ✓ 特征性Tm---DNA的变性温度 82~95℃
✓ 二苯胺反应 DNA 试剂：浓硫酸，二苯胺 现象：蓝色 ✓ 与间苯三酚反应（核苷酸中的戊糖） 现象：玫瑰红色
第九章核酸类药物分析
（二）嘌呤的鉴别
+氨制硝酸银→白色↓→红棕色（遇光） （嘌呤碱基的特殊鉴别反应）
第九章核酸类药物分析
（三）磷酸的鉴别
有机磷→无机磷+钼酸→磷钼酸+还原剂→钼蓝
第九章核酸类药物分析
➢ 取本品1％水溶液，加氨制硝酸银试液数滴， 即产生白色胶状沉淀。---嘌呤碱基
➢ 取含量测定项下的溶液,照分光光度法测定，在 248nm的波长处有最大吸收，在222nm的波 长处有最小吸收。
• 嘌呤——次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、 N2、N2-二甲基鸟嘌呤。
• 嘧啶——5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、 二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶
• 都是基本碱基的化学修饰型。
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O 1-甲基次黄嘌呤
N H3C
N
N
N
H2N
N
H
鸟嘌呤
O N
N
N
H
次黄嘌呤
第九章核酸类药物分析
二、理化性质
➢ （一）两性性质：磷酸基；碱基（通常：酸性） pH影响碱基间氢键稳定：DNA pH4.0~11.0
现在国家已经批准的嘌呤类核苷酸药物一般都用 此法测定含量
➢ HPLC
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四、实例分析
➢ 肌苷 ➢ ATP
第九章核酸类药物分析
（一）肌苷的质量分析
1.结构：C10H12N4O5 268.23
本品为9β-D-核糖次黄嘌呤。按干燥品计算，含 C10H12N4O5应为98.0～102.0％。
➢ （二）水解性：微溶于水，不溶于一般的有机溶剂 ➢ （三）UV：λmax=260nm 蛋白质280nm
A260/A280 纯DNA＞1.8 纯RNA应达到2.0 混有杂蛋白 比值降低
第九章核酸类药物分析
第九章核酸类药物分析
➢ （四）变性和复性 ✓ 1.变性：在某些理化因素影响下，DNA双螺旋区
2.性状：
本品为白色结晶性粉末；无臭，味微苦。 本品在水中略溶，在氯仿或乙醇中不溶，在稀盐 酸和氢氧化钠溶液中易溶。
第九章核酸类药物分析
3.鉴别
➢ 取0.01％供试品溶液适量,加等体积的3,5-二羟 基甲苯溶液(取3，5-二羟基甲苯与三氯化铁各 0.1g，加盐酸使成100ml)，混匀，在水浴中 加热约10分钟，即显绿色。---苔黑酚反应
戊糖
核糖 (in RNA)
2｀－脱氧核糖 (in DNA)
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核苷
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DNA & RNA
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碱基
嘧啶环
RNA
尿嘧啶 U
DNA
胞嘧啶 C
胸腺嘧啶 T 腺嘌呤 A
嘌呤环
鸟嘌呤 G
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类别 基本单位
核苷酸
碱基 五碳糖
酸
DNA
脱氧核糖核苷酸
➢ 1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步 澄清，在X射线衍射技术支持下1953年结构澄清。
➢ 核酸是脱氧核糖核酸（DNA）与核糖核酸（RNA） 的通称。
第九章核酸类药物分析
一、结构和分类
核酸
核苷酸
水
解
磷酸
核苷
戊糖
第九章核酸类药物分析
碱基
核酸
核苷酸
代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA 而言为核糖；
RNA中核糖+浓HCl（浓H2SO4）→糠醛+苔黑酚→深绿色化
合物（ λmax=670nm ）
✓ 二苯胺反应:
DNA中脱氧核糖+浓H2SO4 →5-羟基-4-羰基戊醛+二苯胺→
蓝色化合物（ λmax=595nm ）
✓ 水解后磷酸：
磷酸+钼酸→磷钼酸+还原剂（维生素C、氯化亚锡等） →钼 蓝（ λmax=660nm ）
（四）特征吸收光谱
UV：嘌呤环，嘧啶环 IR
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（五）熔点测定
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二、检查
➢ 一般检查
酸度，水分，无机盐，有机物，溶液的颜色和澄清度
➢ 蛋白质检查
磺基水杨酸溶液
➢ 有关物质
纸色谱，薄层色谱，电泳，荧光检查
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三、含量测定
➢ 紫外-可见分光光度法