2.系统适用性试验
• 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对 照品对仪器进行试验和调 整,应达到规定的要求；或规定 分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和 拖尾因子。 • (1) 色谱柱的理论板数(n) 在选定的条件下，注入供试品 溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量 出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰高宽 (Wh/2),按n=5.54(tR／Wh/2)２
三、核酸类药物的含量测定方法
• • • • （一）滴定分析法 （二）紫外-可见分光光度法 （三）高效液相色谱法 （四）其他分析方法
色谱条件与系统适用性
• 色谱条件：色谱柱的填充剂和流动相的组分应按 各品种项下的 规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶 和化学键合硅胶。除另有规定外，柱温为室温， 检测器为紫外吸收检测器。 • 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流 动相组分、检测器类型不得任意改 变外，其余如 色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流 动相流速、混合流动相各 组分的比例、柱温、进 样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变, 以适应 具体品种并达 到系统适用性试验的要求。一般色 谱图约于20分钟内记录完毕。
第二节 分析、检测的方法
• 一、核酸类药物的鉴别试验
– 一般鉴别试验（化学基团反应） – 紫外吸收法 – 薄层色谱法 – 高效液相色谱法 – 红外吸收光谱法
定性
红外分光光度法IR
• 物质分子吸收波数位于4000-400cm-1范围的红外光而产 生的吸收光谱称为红外吸收光谱。 • 利用红外吸收光谱对物质进行分析的方法称红外分光光度 法。 • 红外吸收光谱是由分子的振动、转动能级引起的光谱。特 征性强，除了光学异构体及长链烷烃同系物外，几乎没有 两种化合物具有完全相同的红外吸收光谱。 • 应用：药物鉴别、 [中国药典]对无效或低效晶型进行检查 • 试样的制备方法除另有规定外，用作鉴别时应按照药典委 员会编订的《药品红外光谱集》收载的各光谱图所规定的 制备方法制备。
另一种是按基团顺序解析，即首先按C=O、O-H、C-O、C=C （包括芳环）、C≡N和—NO2等几个主要基团的顺序，采用肯定与 否定的方法，判断试样光谱中这些主要基团的特征吸收峰存在与否， 以获得分子结构的概貌，然后查对其细节，确定其结构。
注意：在解析过程中，要把注意力集中到主要基团的相关峰上，避免孤立 解析。
s s s
1600— 1500 1300— 1250 1220— 1040
各种官能团的吸收频率范围
C—O 1300— 1000 伸缩 s C—O键（酯、醚、醇类）的极 性很强，故强度强，常成为谱 图中最强的吸收 醚类中C—O—C的 ν as=1100±50是最强的吸收。 C—O—C 对 称 伸 缩 在 900—1000 ，较弱 大部分有机化合物都含有CH3 、 CH2基，因此此峰经常出现
二、核酸类药物的杂质检查
• 一般杂质检查
– 具体包括：具体包括氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属、 砷盐、水分、易炭化物、炽灼残渣、干燥失重等。检 查方法收录于药典附录中，杂质限度要求收录于药典 正文检查项下。
• 特殊杂质检查
– 特殊杂质指某一个或某一类核酸药物的生产或贮藏过 程中引入的杂质，如巯嘌呤中的6-羟基嘌呤、氟胞嘧 啶中的氟尿嘧啶、三磷酸腺苷二钠中的一磷酸腺苷钠 和二磷酸腺苷二钠等、肌苷中的有关物质等特殊杂质。 （思考：各用了什么方法？）
第一节 核酸类药物概述
• 是指具有药用价值的 • 依据核酸类药物及其 核酸、核苷酸、核苷， 衍生物的化学结构和 组成成分4大类： 甚至碱基等一类药物 的统称。 – （一）核酸碱基及其衍 生物 • 按其作用特点可分为：
– – – – – (1)抗病毒剂 (2)抗肿瘤剂 (3)干扰素诱导剂 (4)免疫增强剂 (5)供能剂 – （二）核苷及其衍生物 – （三）核苷酸及其衍生 物 – （四） 多核苷酸类
特征性 特征性强 用途 鉴定化合物类别 鉴定官能团 推测结构
近红外光纤枪
通过应用先进的红外光谱快速检测方法和近红外无损伤探测技术（光纤 探头） ，在笔记本电脑上录入被检药品的化学名、生产厂家等基本资料， 由药品快检人员使用近红外探测枪隔着铝箔包装，对抽检药品照射数秒钟， 就能对有关药品进行简单检测，然后与被检药品基础信息库资料进行比对， 从而快速辨别出药品的真假。对于部分有特定对比模板的被检测药品，最短 可以在3分钟内鉴别出真假。
s m s m,s s s s s s v
四 区 域
根据特征吸收的位置，判断可能存在的特征官能团
IR与UV的区别
IR
起源 适用 分子振动能级伴随转动能级跃迁 所有红外吸收的有机化合物
UV
分子外层价电子能级跃迁 具n-π*跃迁有机化合物 具π-π*跃迁有机化合物 简单、特征性不强 定量 推测有机化合物共轭骨架
内标物+样品→杂质含量
外标法
（3）加校正因子的主成分自身对照法
待测成份对照品+杂质对照品→ 计算校正因子
供试品→供试品溶液 供试品的稀释液→对照品溶液
测量供试品溶液色谱图上各杂质
的峰面积，分别乘以相应的校正因子
后与对照溶液主成分的峰面积比较， 依法计算各杂质含量
优点
准确度高
（4）不加校正因子主成分自身对照法
• 红外光谱法广泛用于有机药物的定性和结构分析， 在药物的鉴别试验中用的非常普遍。 • 迄今为止，国家药典委员会已编排出版了3卷《药 品红外光谱集》作为国家标准系列配套用书，广 泛用于药品的鉴别检验，其中1995年出版了第1 卷，收载了光栅型红外分光光度计绘制的药品红 外光谱图共685幅。2000年出版了第2卷，收载药 品红外光谱208幅，并全部改成了傅里叶红外光 谱仪绘制。2005年出版第3卷，共收载药品红外 光谱210幅（其中172个为新增品种，38个老品种 进行了重新绘制）。
第 二 区 域
伸缩 v
1950 附 近 C=C 芳环中C=C —C=O 第 三 区 域 —NO2 —NO2 S=O 1680— 1620 1600 ， 1580 1500 ， 1450 1850— 1600 伸缩 伸缩 伸缩 s 反对称伸 缩 对称伸缩 伸缩 m， w v 苯环的骨架振动 其他吸收带干扰少，是判断 羰基（酮类、酸类、酯类、 酸酐等）的特征频率，位置 变动大
各种官能团的吸收频率范围
—C≡N —N≡N —C≡C— —C=C=C— 2260— 2220 2310— 2135 2260— 2100 伸缩 伸缩 伸缩 s针 状 m v 干扰少 R—C≡C—H，2100—2140； R—C≡C—R` ， 2190—2260 ；若R`=R，对称分子无红外 谱带
如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变 色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使 理论板数达到要求。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小 理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充 填的优劣等），使 理论板数达到要求。
剂峰以外的总色谱峰面积，计算各
杂质峰面积占总峰面积的百分率， 应符合规定。
优点 缺点
不需杂质对照品，简便易行 检测波长处，各杂质和药物
的吸收强度可能有差异，控制 杂质峰面积百分率不一定就是
杂质限量，准确度差
结论：根据各主要杂质及主成分的紫外吸收特 性，选取响应值基本一致的波长作为有关物质的检 测波长。若对不同杂质难于找到均适宜的检测波长， 可考虑选择在不同波长下分别测定，也可考虑采用 加校正因子的主成分自身对照法。只有经试验研究 确认主成分的最大吸收波长符合有关物质检查对测 定波长的要求时，为方便操作，可选作有关物质的 检测波长，以与含量测定的色谱条件一致。 HPLC主成分自身对照法检查有关物质比较适 用于对微量杂质总量的控制，也可用于单个杂质的 限度（一般不超过0.5%）控制。对于具有明确归属 的已知杂质，建议采用杂质对照品法进行检查。对 于有毒有害杂质，更应采用杂质对照品法单独测定， 并制定严格的限度。
供试品→供试品溶液
供试品的稀释液→对照品溶液 测定供试品溶液中各杂质峰面积，
与对照溶液主成分峰面积比较，控制
杂质的量
优点
不需杂质对照品，可同时控制
各个杂质及其总量限度
缺点
检测波长处，各杂质和药物的
吸收强度可能有差异，准确度
差
（5）面积归一化法
取一定量供试品溶液进样，测 定各杂质的峰面积和色谱图上除溶
• 氟胞嘧啶中的氟尿嘧啶中用什么方法来检 查特殊杂质限量？限量是多少？ • 肌苷中的有关物质的检查用的是什么方法？ 原理是什么？
HPLC用于杂质检查的方法
• • • • • 内标法（加校正因子） 外标法 主成分自身对照法（加校正因子） 主成分自身对照法（无校正因子） 面积归一化法
内标物+ 杂质对照品 →校正因子
红外光谱仪
横坐标波数，纵坐标百分透过率 ，谷底表 示吸收峰。
谱图解析的一般程序
一种是按光谱图中吸收峰强度顺序解析，即首先识别特征区的最 强峰，然后是次强峰或较弱峰，它们分别属于何种基团，同时查对 指纹区的相关峰加以验证，以初步推断试样物质的类别，最后详细 地查对有关光谱资料来 确定其结构；
巯嘌呤中的6-羟基嘌呤
• 问题：薄层层析中硅胶板的规格分为：G ， H，GF254，HF254。这些是根据什么分类 的？ • 答案：硅胶H"-不含粘合剂；"硅胶G"-含煅 石膏粘合剂；"硅胶HF254"-含荧光物质， 可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；" 硅胶GF254"-既含煅石膏又含荧光剂. • H-Hard；G-Glutinous；F-Fluorescent
伸缩 伸缩 伸缩
s s s 反对称伸缩 对称伸缩 反对称伸缩 对称伸缩
区
域
3300附近 3010— 3040 3030附近 2960±5 2870±10 2930±5CH2