（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10X M buffer 5ulH2O 35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI 酶切，反应体系：plko.1载体4ugAgeI 2ul10X AgeI buffer 5ulH2O 39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI 酶切产物30ulEcoRI 2ul10X H buffer 5ulH2O 13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul 退火引物5ul酶切载体1ul 酶切载体1ulSolution I 5ul T4连接酶1ulH2O 2ul T4连接酶Buffer 1ulH2O 2ul室温下连接4h。
（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。
（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。
（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
1、取5ml菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清2、向沉淀加500 ul P1 ，震荡重悬3、加入500 ul P2 ，温和翻转6~8 次，充分裂解（不超过5 min，一般3min）4、加入700 ul P3 ，温和翻转6~8 次，出现白色絮状沉淀，12000 rpm 10 min5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000 rpm 2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000 rpm ，1min ，弃废液6、CP4柱中加入500 ul PD ,12000rpm ，1 min ，弃液7、CP4柱中加入600 ul Pw,室温放置3 min ,12000rpm ，1 min ，弃液8、空离12000rpm ，2 min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）9、CP4柱置于1.5ml 离心管，向柱中心加35 ul ddH2O ，室温放置2 min ，12000rpm ，1 min。
（八）、测质粒浓度打开软件，ddH2O 清洗仪器3~5次，点击black ，F1，结果不大于0.2每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500，OD值1.88~1.90质粒置于-20 ℃，保存（九）、细胞复苏1、37℃预热PBS，取8ml PBS 于10 ml 离心管中2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温800 rpm 3min ，去上清，加入1ml 培养基重悬，4、细胞重悬液加到含8ml 培养基的培养皿中，37℃，5% CO2 ,培养（十）、细胞分盘1、吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，室温，5 min4、加入1ml培养液重悬，按1；3 分盘（十一）、转染1、PLP1 625 ng/孔PLP2 625 ng/孔2ml 离心管PLP/VSVG 625 ng/孔混匀目的质粒625 ng/孔Opti 培养基500ul/孔2、脂质体6ul/孔2ml 离心管请轻混匀，室温下孵育，5 minOpti 培养基500ul/孔将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3 ml PBS 清洗，加1ml 胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750 rpm，室温，5 min；弃上清，加入Opti 培养液重悬4、在六孔板中加入850ul Opti 培养液，加入包装的脂质体，混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀，37℃，5% CO2 ,培养，6~8h 后去除培养基，加入3ml 新转染培养基，继续培养两天（十二）、收病毒培养第四天的转染细胞，用注射器吸取培养基，用0,45um 滤膜过滤到1.5ml 离心管，每管1 ml。
最后向培养皿中再加3ml转染培养基，，继需培养，第二次收病毒。
（十三）、病毒转染细胞1、取培养的目的细胞，吸去培养液，加入1ml 含4 ug/ml polybrene 的慢病毒培养基，再加入1 ml 病毒液，混匀，37℃，5% CO2，培养48h2、将感染的目的细胞加到生长培养基培养，3、用适当浓度的抗生素筛选靶细胞4、收细胞（十四）、收细胞（用于提蛋白，提RNA）1、吸去培养液，加入PBS 清洗2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，4℃，5 min4、弃上清，加1ml PBS，重悬，转移到1.5ml 离心管1000 rpm ，4℃，5 min5、弃上清，立刻放入液氮中保存。
（十五）、冻存细胞1、准备冻存液2、吸去培养液，加入PBS 清洗3、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min4、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，4℃，5 min5、弃上清，加入1 ml 冻存液重悬，转移到冻存管。
（十六）、提蛋白1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入细胞裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30min2、13000 rpm ，4℃，10min ，弃沉淀3、配制蛋白标准液，稀释至0.5 mg / ml ，配制BCA 试剂（A液：B液= 50:1）4、标准液体积按0；1；2；4；8；12；16；20 加入96 孔板，补PBS 至20ul5、96孔板加1 ul 蛋白样品，PBS 补足20 ul ，每个重复3次6、每孔加入200ul BCA ，37℃，30 min7、酶标仪560 nm 测吸光值8、将蛋白样品稀释，加入loding buffer，4℃，瞬时离心，100℃煮10 min，13000 rpm，30 s（十七）、WB1. 清洗玻璃板2. 灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时待胶面升到绿带下线高度时即可。
然后胶上加异丙醇，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）（3）待胶凝后，倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干。
（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
（5）将胶板安装到电泳架上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
），倒入电泳buffer，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
点样，marker，10 ul （上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。
）（5）将其放入电泳槽中。
3. 电泳电泳时间一般100 V，90 min 。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
4、转膜1. 剪取一张5.5 X 8.5 的PVDF 膜。
将切好膜置于甲醇中浸泡，激活，转移到去离子水中清洗。
最后在转膜buffer 中清洗。
2. 在加有转膜buffer的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块滤纸垫、一支滚棒、带胶的玻璃板。
3. 在转膜盒上面铺一张滤纸垫，加入转膜buffer，用滚棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 将膜铺于滤纸上；5、将玻璃板撬开，除去大玻璃板后，将浓缩胶切去，取下分离胶盖于膜上上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
最后盖上另一个滤纸垫，擀几下盖上盖子。
6. 将转膜槽放入转膜仪。
25 V，30min。
5、封闭1、转膜后，移至含有封闭液的平皿中，室温下，摇床上，封闭2 h。
2、封闭后，1 x TBST 清洗3次，加入一抗，4℃，过夜；3、回收一抗，1 x TBST 清洗3次，每次10 min；4、加入二抗，室温1 h5、弃二抗，1 x TBST 清洗3次，每次10 min。
6、显色曝光将膜放到曝光仪上，加入显色液，曝光（十八）、提RNA1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入500 裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30 min2、13000 rpm ，4℃，5 min ，弃沉淀3、加入适量（350ul ~450ul）的RTL lysis Buffer 至离心管，重悬4、加入等体积RNA Binding Buffer 至离心管，混匀5、把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管，转移小于700ul 混合液，12000rpm，30s6、弃滤液，继续转移7、加500 ul Buffer RW1 ,12000rpm，30 s8、弃滤液，加入650 ul Buffer RW2，12000rpm，30 s9、弃滤液，空离10、柱子转移至1.5ml 离心管，加入30~100 ul RNase Free Water 至膜中央，静止1 min，12000rpm，1 min（十九）、PCR 合成cDNA解链反应体系：总RNA 1~2 ul引物 1 ulOligo（dT） 1 ul无RNA酶水补足8 ul70 ℃水浴5 min；冰上5 min逆转录体系：5 X M-MLV buffer 5 uldNTP 2ulRNase 抑制剂 1 ulM-MLV 1 ul无RNA酶水8 ul总体积25 ul42℃，90 min ；70℃，10 min PCR，-20 ℃保存（二十）、RT-PCR利用持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH 作为内参基因，采用荧光定量PCR 的方法检查基因的表达水品。