蛋白质研究技术
•蛋白质含量测定 •蛋白质分子量测定 •蛋白质电泳分析 •蛋白质层析分析 •蛋白质免疫分析 •现代蛋白质研究策略
1 蛋白質定量法
• Biuret 法 銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質胜鏈上的 carbonyl 基結合，生成紫色的複合物. • Lowry • UV 吸光法: 由於各種蛋白質所含芳香族氨基酸組成不一， 它們在 280 nm 的吸光能力亦不同 • Coomassie Blue (dye binding) 法
2 分子量测定
• • • • • • • 膠体過濾法 梯度電泳法 其他分子量測定方法 a 超高速離心法 b 由氨基酸序列計算分子量
以电泳确定蛋白质的分子量
3 蛋白質構造與組成分析
• • • • • • • • • • • N-端或 C-端氨基酸決定 氨基酸組成分析 氨基酸定序法 cDNA 間推法 Edman 直接定序法 短肽图譜 蛋白質的專一性水解 檢定胜汰群的方法 其他相關方法 分子消光係數 蛋白質分子結構分析
N-端或 C-端氨基酸決定：
• C端序列分析 C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸 酐，环化，进一步转化为乙内酰硫脲 （TH）→ Alkylation烷基化修饰硫原子，形成ATH 衍生物→ 酸性条件下，ATH衍生物与[NCS]-反应 而被裂解生成ATH-氨基酸，新的C末端 自动形成TH。
B 蛋白质序列拼接
4 蛋白质分析技术
免疫學工具的利用︰
• 若能得到蛋白质的抗体，則對此蛋白质的 研究將有非常大的幫助，因為抗体的專一 性很高，可做為專一性的探針，廣泛地應 用在 ELISA、免疫沉澱 或 免疫轉印 上。
蛋白质分析技术
蛋白質的微量分析技術
总蛋白分析
总结
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蛋白质相关研究技术
• 用几种的方法断裂多肽样品，形成 几套肽段，分别测定肽段的氨基酸序列 后，根据不同裂解方法得到的肽段不同， 找出不同裂解方法下具有的共同跨切口 的重叠肽，可以拼接出整个多肽的氨基 酸序列。
C 蛋白质测序的新方法
• 用测定核酸序列的方法推测蛋白质的序 列： 以待测蛋白质为抗原免疫动物得到 相应的抗体，并以此抗体去沉淀合成这 种蛋白质的多核糖体，分离出其中的 mRNA并将它反转录成cDNA，通过测定 cDNA的核苷酸序列，反推知蛋白质的氨 基酸序列。
A 氨基酸序列测定
• 蛋白质序列测定的关键步骤： （1）氨基酸残基一个一个依次从蛋白质和多 肽的末端切割下来（化学法）： （2）正确鉴定每次切割下来的氨基酸残基 （衍生生色基团，HPLC分离分析） • N端序列分析 N端分析原理：Edman降解法 N端蛋白质自动序列仪 N端封闭：甲酰甲硫氨酸、乙酰丝氨酸、苏 氨酸
DNA
RNA (mRNA)
?
protein
蛋白质测序新方法原理
• 由蛋白質基因的核甘酸序列，可推得其 氨基酸序列，是目前最常用的定序方法 (reverse biochemistry)。 此基因一般選殖 自 cDNA 庫，在經過群殖、定序等工作， 轉譯成蛋白質的氨基酸序列後，就可進 行系統性的分析工作；通常以 電腦程式 搜尋比對，例如 PC/GENE (個人電腦用) 或 GCG (工作站)。