酶工程电子教案第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。
◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。
1.细胞破碎◆细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。
表3-1 细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法◆通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。
◆常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。
◆机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。
1.2物理破碎法◆通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。
物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
◆常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。
(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。
常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。
(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。
1.3化学破碎法◆通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。
◆常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
◆有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。
◆表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。
1.4酶促破碎法◆通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。
◆将细胞在一定的pH值和温度条件下保温一段时间，利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。
◇自溶法效果的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条件的选择与控制。
◇为了防止其他微生物在自溶细胞液中生长，必要时可以添加少量的甲苯、氯仿、叠氮钠等防腐剂。
◆根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中，使细胞破裂。
2.酶的提取◆酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。
也称为酶的抽提。
◆酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
2.1酶提取的主要方法表4-2 酶的主要提取方法2.2影响酶提取的主要因素◆主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。
◆此外，还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响。
(1)温度：提取时的温度对酶的提取效果有明显影响。
一般说来，适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度。
(2)pH值：溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著影响。
为了提高酶的溶解度，提取时pH值应该避开酶的等电点。
(3)提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。
但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。
所以提取液的总量一般为原料体积的3～5倍，最好分几次提取。
此外，在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小，则扩散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌可以使提取液中的酶分子迅速离开原料颗粒表面，从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速率；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出来，直至达到平衡。
在提取过程中，为了提高酶的稳定性，免致在引起酶的变性失活，可适当加入某些保护剂。
如酶作用的底物、辅酶、某些抗氧化剂等。
3.沉淀分离◆沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
◆沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。
◆沉淀分离的方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。
表4-3 沉淀分离方法3.1盐析沉淀法◆盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。
盐蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。
◆一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。
◆而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。
◆盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。
由于反离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。
◆酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。
它们之间的关系可用下式表示：SLog ＝ - K s IS0式中，S：酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度（g/L）S0：酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L）K s：盐析系数I：离子强度在温度和pH值一定的条件下，S0为一常数。
所以上式可以改写为：LogS = LogS0 - K s I =β- K s I式中，β= LogS0，主要决定于酶或蛋白质的性质，也与温度和pH值有关。
当温度和pH 值一定时，β为一常数。
K s为盐析系数，主要决定于盐的性质。
K s的大小与离子价数成正比、与离子半径和溶液的介电常数成反比，也与酶或蛋白质的结构有关。
◆离子强度I 是指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。
即：1I = —∑m i Z i2式中，m i ：离子强度（mol/L）Z i：离子价数2◆对于含有多种酶或蛋白质的混合液，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。
◇在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为K s分段盐析；◇而在一定的盐和离子强度的条件下（K s I为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。
◆在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
其中以硫酸铵最为常用。
◆在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。
饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值。
3.2等电点沉淀法◆利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀法。
◆由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在,在实际使用时，等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。
◆在加酸或加碱调节pH值的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起的酶变性失活。
3.3有机溶剂沉淀法◆利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。
◆有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
◆常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右，不同的酶和使用不同的有机溶剂时，有机溶剂的使用浓度有所不同。
◆有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。
3.4复合沉淀法◆在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方法称为复合沉淀法。
◆常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。
3.5选择性变性沉淀法◆选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。
◆根据酶和所含杂质的特性，通过加热或改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。
◆在应用该法之前，必须对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类，含量及其物理、化学性质有比较全面的了解。
4.离心分离◆离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
◆在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
4.1离心机的选择◆离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类，可以分为常速（低速）离心机、高速离心机和超速离心机3种。
◇常速离心机（低速离心机）：最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104×g 以下。
主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。
也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
◇高速离心机（设有冷冻装置）：最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到1×104～1×105 ×g。
主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。
◇超速离心机：最大转速达(2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达5×105×g甚至更高。
主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。
4.2离心方法的选用◆对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和离心时间，就能达到分离效果；◆如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。
◆而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。
4.2.1差速离心：◆差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。
4.2.2密度梯度离心：◆密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。
◆为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。
密度梯度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。
这种溶质称为梯度介质。
◆常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。
使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是：蔗糖浓度5～60%，密度范围1.02～1.30 g/cm2。
◆密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。
制备得到的密度梯度可以分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等(图4-1)。
◆密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成，如图4-2所示。
B Aa b c图4-1 三种梯度形式示意图a:线性梯度 b:凸形梯度 c:凹形梯度图4-2 梯度混合器示意图A:混合室 B:贮液室电磁搅拌器◆离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。