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Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（北京鼎国生物技术公司）１：ＥｃｏＲＩ（０２ｐＬ）／Ｍ删Ｉ（０２ｐＬ）２：ＥｃｏＲＩ（Ｏ．３ＰＬ）／ＭｓｅＩ（０３止）３：６７一『ＹＪＲＩ．（０４￡ｔ１．）／ＭｍＩ（０．４ｖＬ）４：Ｆ“，ＲＩ（０．５ｖＬ）／Ｍ∞Ｉ（０５／ＬＬ）５：ＥｃｏＲＩ（０６ｐｌ。

）／Ｍ．∞Ｉ（０．６ｐＬ）６：ＥｃｏＲＩ（ｆ）７ｆｍ）／ＭｓｅＬ（０７“Ｌ）７：ＥｃｏＲＩ（Ｏ８¨Ｌ）／Ｍ，ｅｌ（０８ｇＬ）８：ＥｃｏＲＩ（Ｏ９ｖＬ）／ＭｓｅＩ（０９ｔｚＬ）
圄１小麦基因组ＤＮＡ不同酶切用量的酶切效果
从图１可看出，５泳道的ＥｃｏＲＩ（０．６＂Ｌ）和Ｍｓｅｌ（０、６“Ｌ）的酶切效果比较理想，基因组１００～ｌ８００ｂｐ问的ＤＮＡ片段都有出现。

ＥｖｏＲＩ和ＭｓｅＩ两种酶用量各为０．２ｕＬ时酶切ＤＮＡ片段为７００～Ｉ８００ｂｐ之间，各Ｈｊ０．３“Ｌ的酶切片段在５００～一Ｉ８００ｂｐ之间，各用０．４“Ｌ的酶切片段在４００～１８００ｂｐ之间，各用０．５＂Ｌ的酶切片段在２５０～１８００ｂｐ之间。

由此可见，由于限制性内切酶』甘量太少，酶切不完全，基因组多态性不丰富。

在６、７、８泳道则酶用量太多，既造成浪费，也容易出现酶切过头现象，产生许多低于１００ｂｐ的ＤＮＡ片段，导致接头连接不上，ＰＣＲ反应失败的结果。

６、７、８泳道的两种酶总用量分别是１．４、１．６、１．８ＨＬ，都接近或超过总反应体系１５止的ｌ／１０（１，５止）。

显而易见，一般两种酶的总量不能超过反应体积的ｌ／１０。

２限制性内切酶的缓冲液选择
在双酶切过程中，如果两种酶反应温度一致而缓冲液不同时，可查阅内切酶供应商提供的各种酶在不同缓冲液中的话力表。

如果一种缓冲液能同时使两种酶的活力都超过７０％，便可用这种缓冲液作为反应缓冲液。

如果两种酶厂家不同，可比较其缓冲液成份，倘若相似，可各取一半中和，也可使用通用缓冲液。

例如，作者在进行小麦抗锈基因的ＡＦＬＰ标记研究中，选用Ｅ∞Ｒｌ（上海生工）和ＭｓｅＩ（纽英伦生物有限公司）两种限制性内切酶，分别查阅并比较了卜述公司的酶在不同缓冲液中的活力表，确定用ＢｕｆｆｅｒＹ＋／ＴＡＮＧＯ…（表１）。

从表１可见，ＥｃｏＲＩ和Ｍ”Ｉ两种酶在２倍Ｂｕｆｆｅｒｙ＋／ＴＡＮＣｒ）ＴＭ中括力均为１００％，而且没有过度消化现象。

因而选用２倍液Ｂｕｆｆｅｒｙ＋门＂ＡＮＧＯ＂‘”
寰１限制性内切酶ＥｃｏＲ［和ＭｓｅＩ在苇同缓冲液中韵酶活力情况
１）ＨｕｆｆｅｒＢ＋（蓝）Ⅲ１０ＩＩｍｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７５）。

１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；２）ＢｕｆｆｅｒＧ＋（绿）：１０ｍｍｏ］／Ｉ，ＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ７５）．１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２，５０ｍｍｏ］／Ｉ。

ＮａＣＩ，０．１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；３）ＢｕｆｆｅｒＯ＋（橘）：１０ｍｍｏ［／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７５）・１０ｎｍａｏｌ／ＬＭｇＣＩｚ，１００ｍｍｏ［／ｌ—Ｎ《１．０１ｍｇ／ｍｌ。

ＢＳＡ；４）ＢｕｆｆｅｒＲ’（红）：ｉｏｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣＩ（ｐＨ８５），１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌｚ，１００ｍｍｏｌＡ—ＮａＣ［。

０１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ；５）ＢｕＨｅ“＋，ｌ＇ＡＮＧＯⅢ：３３ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ８ｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７９），１０ｍｍｏｌ／Ｉ，Ｍｇａｅｅｔｓｔｅ，６６ｍｍｏｌ／ＬＫＲｅＳｔａｔｅ，０１ｒａｇ／ｍＬＦＫｑＡ。

作为２种内切酶的通用缓冲液。

３酶切时间
酶切时间是双酶切时较易忽略的问题，但却是酶切成败的关键。

酶切时问过长，许多酶可能出现新的活性，就不能在原定的酶切位点切割，使接头连接不上，ＰＣＲ反应无结暴。

在作琼脂糖检测时，Ｍａｒｋｅｒ１００ｂｐ条带下方出现一片弥散，很可能就是酶切时间太长所致。

因为ＡＦＬＰ经过ＰＣＲ反应扩增出的产物主要在１０００ｂｐ左右，范围可在１００～１５００ｂｐ之间，小于１００ｂｐ的小分了量片段，接头可能连接不ｒ。

这是引起ＰＣＲ扩增不出结果的原因之一。

酶切时间太短，酶坷Ｊ不完全，酶切片段就不能覆盖整个基因组，影响ＰＣＲ扩增的多态性。

一般来讲，酶切时间长短与酶的性质有关，具体
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旦！：垒盟！Ｐ—ＲＯＴＥＣ—ＴＩＯＮ
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要参看其说明。

在进行第一次酶切时，可进行梯度实验。

每隔半小时或一小时点样观察一次，增加Ｍａｒｋｅｒ，注意酶切分子量的大小。

作者在使用
ＥｃｏＲＩ（上海生工）和ＭｓｅＩ（纽英伦生物有限公司）进行双酶切时，设计以下时间段，获得了不同的酶切效果（图２）。

Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（北京鼎国生物技术公司）；１酶切１ｈ；２酶切４ｈ；３酶切７
ｈ
４酶切１０ｈ；５酶切１３ｈ；６．酶切１４ｈ；７酶切１７ｈ
圈２小麦基因组ＤＮＡ不同酶切时间的酶切效果
从图２可看出，５、６泳道酶切１３ｈ和１４ｈ的效果比较理想。

１、２、３、４泳道的酶切时间太短，酶切不完全，多态性不丰富；７泳道酶切时间太长（１７ｈ），出现酶切过头现象，使接头连接不上，造成ＰＣＲ反应失败。

４反应温度及分步酶切
如果两种酶的反应温度不同或两种酶的缓冲液成份相差较大则必须分步酶切。

第一种酶切后用酚抽提、电泳或加热等方法使酶失活，再进行下一次酶切反应。

厂家目录一般都有相应的附录以供查『列各种酶的反应温度。

第一次酶切后，通过电泳确证酶切效果，从胶中吲收ＤＮＡ片段进行下次酶切，也可在第一种酶切后直接用ＰＣＲ产物回收试剂盒纯化酶切样品（约需
５
ｍｌｎ），保留少量样品进行电泳分析，其余进行第二
次酶切。

亦可用离心纯化管或离心浓缩管，将酶切样品进行离心，过滤盐等成分，而核酸则被截留在柱子中间的膜上，加入适量ｄｄＨ，Ｏ，离心洗去膜ｒ残留的杂质，再加几微升ｄｄＨ：Ｏ在膜上，将柱子反转插入新的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管上离心，即可分离获得ＤＮＡ片段，做下一次酶切。

５其他注意事项
（１）双酶切时如果两种酶的酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。

因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效纠割。

有的酶要求识别序列两端有多个碱基，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。

例如，质粒ｐＬＩＴＭＵＳ２９的多克隆位点中ＢａｒｎＨＩ旁边有
Ｈ／ｎｄⅢ位点，如果先切ＢａｍＨＩ再切Ｈ／ｎｄⅢ时就会出现Ｈ／ｎｄＨＩ切不开的情况。

（２）ＤＮＡ酶切完成后，经加热将限制性内切酶失活。

其失活温度和时间根据酶的种类而定。

例如，ＥｃｏＲＩ的失活温度是６５℃，ＭｓｅＩ失活温度是８０℃。

因此，酶切后，一般采用８０℃水浴２０ｒａｉｎ的方式使之失活。

（３）酶失活后，将酶切片段连接到特定的接头上。

加热酶切有时并不能达到很好的效果，可能会对连接产生影响，在此情况下可采用酶切后沉淀的方法，具体操作如下。

（ａ）加１／１０体积，ｐＨ５．２的ＮａＡｃ和２倍体积无水乙醇沉淀，在２０℃放至２ｈ以上。

（ｂ）４℃，１５０００ｒ／ｍｉｎ或以上，离心１５ｒａｉｎ。

（ｃ）倒上清液，７０％乙醇洗２～３遍。

（ｄ）干燥机干燥５～７
ｒａｉｎ。

（ｅ）加ＴＥ复溶，即可用于连接反应。

（４）用Ｔ４连接酶进行连接反应时，注意Ｔ４连接酶的最适反应温度为２２℃，连接８～１２ｈ，习惯于连接过夜。

参考文献：
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