API的保留时间一般在5～15min，主峰峰型好，理论板数5000以上。
API的配制浓度：根据扫描结果
分离度
分别取各杂质及供试品配成一定浓度，分别进样。
分离度溶液：配制成含API的浓度及各杂质浓度为1%（API的有关物质测定浓度）（进6针）
杂质与主峰的分离度应大于1.5
检测波长的确定
在流动相条件下进行UV扫描
杂质峰的拖尾因子≤2.0；
分离度及理论塔板数应符合质量标准的规定
杂质为订入标准中的杂质
方法专属性1
精密量取流动相
供试液1份
每份各1针
空白溶剂应无干扰；
精密度
在规定的测试条件下，同一均质供试品，经多次取样进行一系列检测所得结果之间的接近程度（离散程度）
仪器精密度
供试液及自身对照液
自身对照液1份
进6针
峰面积RSD≤2.0%
分别取各杂质及供试品加甲醇（或乙腈）溶解并稀释制成各约含XXug/ml（一般10ug/ml）的溶液，进行UV扫描（200nm～400nm）
溶剂：能溶解供试品或各杂质的单一溶剂（可向合成咨询溶剂及供试品或各杂质的溶解情况）
浓度：吸光度读数以在0.3～0.7之间为宜
色谱条件摸索（流动相、色谱柱的摸索）
先查文献或各国药典
分离度、仪器精密度、LOD、溶液稳定性、空白干扰
不加校正因子的主成分自身对照法
中间体
检测波长的初选、分离度、检测波长的确定
分离度、仪器精密度、LOD、溶液稳定性、空白干扰
面积归一化法
API
检测波长的初选、分离度、检测波长的确定
分离度、强制降解试验、仪器精密度、LOD、溶液稳定性、空白干扰、耐用性
不加校正因子的主成分自身对照法
杂质对照品溶液1份
供试品进1针
杂质对照品溶液进3针
报告限以上的杂质个数一致，外标法计算杂质的含量，RSD不得大于15%。
中间精密度
供试液
杂质对照品溶液
供试液6份（另一个人员、不同仪器、不同时间）
杂质对照品溶液1份
供试品进1针
杂质对照品溶液进6针
报告限以上的杂质个数一致，外标法计算杂质的含量，12个数据RSD不得大于20%。
外标法测定的杂质
溶液稳定性
供试液
供试液1份
0、1、2、4、6、8、24小时各进1针
主成分的含量变化的绝对值≤2.0%；
杂质含量的绝对值在±0.1％以内，
并不得出现新的大于报告限度的杂质
峰面积及峰面积的归一化含量
耐用性
供试液
系统适用性溶液
调流动相pH变化±0.2
1份供试液和1份系统适用性溶液，各条件下进2针
主峰的拖尾因子不得大于2.0；
主峰与杂质峰必须达到基线分离；主峰与杂质峰分离度符合质量标准；
各条件下的峰面积RSD符合规定；
杂质含量的绝对值在±0.1％以内
调流动相配比变化±5%
柱温±5℃（如有柱温）
不同（批号）色谱柱
流速相对值变化±20％
缓冲液中盐的浓度±10％
方法精密度
供试液
杂质对照品溶液
供试液6份
供试液仪器精密度供试液1份
进6针
峰面积RSD≤2.0%；
保留时间RSD≤1.0%
检测限
供试品或杂质适量，用流动相溶解并逐级稀释
供试品溶液1份
检测限2针；
S/N≥3或2。
研究的所有杂质
定量限
供试品或杂质适量，用流动相溶解并逐级稀释
供试品溶液1份
定量限6针；
S/N≥10。主成分及杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。
一般项目方法学验证方案
表一原料药检测项目及方法学验证方案
名称
检测项目
方法学验证
起始原料
性状、溶解度、鉴别、比旋度（手性中心）、干燥失重、炽灼残渣、残留溶剂、重金属、有关物质、含量
残留溶剂、有关物质、含量
中间体
性状、有关物质、纯度
有关物质、纯度
API
性状、溶解度、引湿性、熔点、比旋度（手性中心）、鉴别、干燥失重或水分、硫酸盐、氯化物、重金属、炽灼残渣、残留溶剂、粒度、晶型、有关物质、含量
线性
不同浓度的各杂质对照品溶液
至少5个浓度（LOQ～限度的150%）
各进2针
相关系数（R）不得小于0.9990，Y轴截距应在100%响应值的25%以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。
回收率
供试液
杂质对照品溶液
供试液9份（三个浓度：50%、限度、120%各3份）
杂质对照品溶液1份
供试液各进2针
杂质对照品进6针
表五有关物质方法学验证具体内容
试验内容
溶液配制方法
溶液配制份数
进样针数
评定标准
备注
系统适用性
分别取供试品、各杂质适量，加流动相超声溶解，并稀释配制成约含供试品XXmg/ml和含杂质各1%（相当于供试品浓度XXmg/ml）的混合溶液作为系统适用性溶液。
供试液1份
进6针
杂质峰峰面积RSD≤ 2.0%；
保留时间RSD ≤1.0%；
分离度、强制降解试验、系统适用性、仪器精密度、LOD、LOQ、线性、溶液稳定性、空白干扰、耐用性
加校正因子的主成分自身对照法
分离度、强制降解试验、系统适用性、仪器精密度、方法精密度、中间精密度、溶液稳定性、空白干扰、LOD、LOQ、线性、回收率
外标法
表四有关物质色谱条件摸索
名称
试验内容
备注
检测波长的初选
各浓度下的平均回收率应在80%-120%（低浓度为定量限，放宽至70%-130%），RSD(%)不大于10.0%
强制降解试验
供试液
控制溶液、空白溶液、酸破坏、碱破坏、光破坏、氧化破坏、热破坏、酸碱空白溶液、氧化空白溶液
各进1针
空白不干扰降解产物的检出，
残留溶剂、粒度、有关物质、含量
表二片剂检测项目及方法学验证方案
名称
检测项目
方法学验证
片剂
性状、鉴别、水分、重量差异、有关物质、溶出度、含量均匀度、含量、微生物限度
有关物质、溶出度、含量均匀度、含量、微生物限度
表三有关物质方法学验证内容
名称
有关物质色谱条件摸索
有关物质方法学验证
HPLC
起始原料
检测波长的初选、分离度、检测波长的确定