2．干燥 室温自然干燥或吹干。
3．固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。
4．染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之 覆盖2分钟。
5．水洗 斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边 缘冲洗，直至水呈无色为止。
6．干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。
(二)革兰氏染色 7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1min，水洗，吸水纸吸干
食品微生物技术
实训项目教程
适合专业（群）：食品加工技术专业群
教师：万国福
行动领域 任务二 微生物形态镜检观察 任务三 玻片制作
任务四 常用染色技术 任务五 菌落形态观察
任务四 常用染色技术
一、目的 1、学习微生物的染色技术，掌握微
生物的单染色法和革兰氏染色法。 2、学习油镜的操作。
二、染色原理和油镜的工作原理
1．油镜工作原理 油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径
小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻 片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不 同，有些光会因折射或 反射而 不能进入镜头， 物象就显 现不清。 为了不使通过的光线有 所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃 (n=1.52）相仿的香柏油 (n=1.515)。故而称之为 “油镜”。
3．革兰氏染色法：
革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞 壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细 菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫 -碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处 理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主 要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用 乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低 ，使得结晶紫－碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽 经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由 于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时 ，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的 复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上 复染剂的颜色。
三．实验器材 1．显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等 2．结晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黄染液 3．菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等
四．实验内容
(一) 单染色
1．涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区 域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用 接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水 中，和匀后涂成薄膜。
。 8. 脱色 滴加95% 乙醇数滴使之覆盖16S，立即水洗,吸干 。
9. 复染 用沙黄（番红）液复染 2min，水洗，吸干。
(二) 镜检 先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品
区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域 滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油 中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。
2．单染色法
微生物不但个体微小，且无色半透明。要 在显微镜下观察清楚，必须染上颜色 。微生物 细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质： 在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中 给出质子而带负电。等电点一般在pH=2~5。 所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物 细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色 部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结 合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成 鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。
油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液 檫拭油镜头。再用干的檫镜纸檫干镜头。
Hale Waihona Puke 五．实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜
下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。
阴性
阳性