血红蛋白的催化活性比较
◇基于血红蛋白的上述结构特点，我们研究 了对甲基酚浓度对血红蛋白催化反应速率 的影响情况。实验结果显示，当对甲基酚 浓度较低时，其与反应速率成正比，表现 为一级反应。随着对甲基酚浓度的增高， 表现为混合级反应。当对甲基酚浓度大于 3×10-4mol/L 时，反应速率不再上升，此时 反应速率与对甲基酚浓度无关，表现为零 级反应。
• 样品测定
收集不同地方的雨水，直接测定，结果见表2。
血红蛋白具有价廉易得、贮存方便、实验条件温 和等优点，相信其过氧化物酶的特性会在临床及 生命相关物质的测定中起到重要的作用，并会得 到广泛的应用。
谢谢！
• 干扰情况 以1.1×10-6mol/L H2O2 的测定考察了不同干扰离子 的影响，当要求相对误≤5％，外加离子的允许量 （摩尔比）为：F－ 、SCN－、NO3－ 、Br－、PO43 － 、CO 2－ 、Ba2+ 、Mo（V）、Cr3+（1000倍）； 3 Al3+ 、Mg2＋ 、Sn(Ⅳ)（500倍），Hg2+ 、Ni2+ 、 NO2－（200倍），Ag+ 、Cu2+（100倍），D-葡萄 糖、Fe3+（20倍）、Zn2＋（100倍），尿酸、Co2+ （5倍），Mn2+（1倍）。
◇按同样方法实验测得了氯化血红素和合成 的环糊精-氯化血红素（β-CD-Hemin）等过 氧化物模拟酶的 K m 、V m 和 K cat 值(表1)。 比较发现，这3种铁卟啉化合物对底物对甲 基酚的催化氧化活性顺序为 ： Hb ＞β-CD-Hemin＞Hemin
过氧化氢测定条件的选择
⇘酸度及氨浓度 ⇘对甲基酚浓度
◊ 本文用 Hb 作为催化剂催化 H2O2 氧化对甲基酚的反应，建立了测定
H2O2 的高灵敏荧光分析方法。
实验部分
➮ 仪器与试剂 ➮ 实验方法
仪器 试剂
RF-5301PC 荧光仪；SFM-25 荧光 仪 ；PH-3C 数字型精密酸度计；GS501 超级 恒温槽。
血红蛋白生化试剂，配成1×10-5 mol/L的水溶液；对-甲酚(99%)移取105.6μL,用 二次蒸馏水稀释至100mL，得1×10-2mol/L的 储备液；H2O2：移取0.1mL30%的分析纯过氧 化氢稀释至100 mL，得1.064×10-2 mol/L的储 备液 ，棕色瓶装 ，冰箱保存，使用时依实验 需要进行稀释 。所用其他试剂除注明外 ，均 为分析试剂，所用水为二次蒸馏水。
结果与讨论
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体系的荧光光谱 血红蛋白的催化活性比较 过氧化氢测定条件的选择 分析方法特性 干扰情况 样品测定
体系的荧光光谱
⇨ 用血红蛋白催化对甲基酚与H2O2的反应得到的 荧光产物为2,2’ - 二羟基 – 4，4’- 二甲基联苯， 其荧光的激发和发射光谱如图1（a），最大激发 和发射波长为λex / λem =318nm/427nm 。 ⇨ 需要指出的是，血红蛋白在本实验条件下亦产 生微弱的荧光，这是由于其分子中肽链上的色 氨酸和酪氨酸所致。然而其最大激发和发射波 长为λex / λem =318nm/427nm（如图1 b）对本体 系只产生微弱的本底值 。
⇩在 10 mL 比色管中依次加入系列 H2O2 溶液；
1×10-3 mol/L 对甲基酚 1.0 mL ；pH=10.3 的 NH3-NH4Cl 缓冲溶液 3.0 mL；1×10-5 mol/L 血红蛋白 0.50 mL 。用二次水定容，混合均 匀后，室温放置 10min ，测定产物在激发波 长 318nm ，发射波长 427nm 处的荧光强度。 ☆
• 血红蛋白（Hb）的浓度 由于血红蛋白是一荧光物质 ，尽管在本实 验选定的条件下荧光强度很弱，然而当其 浓度太大时，会导致较大的空白值，并且 造成浪费。当浓度很低时，在测定时间内 催化反应不完全。实验结果表明：当血红 蛋白浓度在 2×10-7 ～6×10-7 mol/L时，体 系荧光强度最大且恒定 。 本实验选择 5×10-7mol/L为最佳用量。
⇘血红蛋白（Hb）的浓度
• 酸度及氨浓度 酸度是酶催化反应需要用缓冲溶液严格控制 的条件之一。我们比较了NH3-NH4Cl、甘氨 酸-NaOH、硼砂-NaOH、NaHCO3及混合酸NaOH等缓冲体系。发现在NH3-NH4Cl缓冲 溶液中，当pH 10.3时产物的荧光强度最大。 同时我们固定这一酸度实验了NH3浓度对体 系荧光强度的影响情况，结果显示的最佳 氨浓度是0.03mol/L。表明血红蛋白的催化 活性也可被氮配体（如NH3）所增
本文采用血红蛋白作为过氧化物酶 的替代物，用于催化 H2O2 氧化对甲 基酚的反应体系。从而建立了高灵敏 测定痕量 H2O2 的荧光分析法。
引言
痕量 H2O2 的测定不论是在临床生 物化学还是在环境化学中都有重要 意义。酶法测定 H2O2 一般是基于 过氧化物酶催化 H2O2 氧化底物的 反应来实现的。
血红蛋白的催化活性比较
◇利用Linewear-Burk图，由截距和斜率求得 Vm = 1.6 min-1 ，K m = 8.75×10-4mol/L，再 由方程：Vm = Kcat [ E 0 ] 求得酶催化的转换 数 Kcat = 6.4×106L/ mol· min 。
血红蛋白的催化活性比较