2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 NNaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。
溶液I中各成分的作用
葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，因此有些试剂厂商的溶液I没有葡萄糖成分；EDTA是Ca2+；‘和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。
溶液II中各成分的作用
NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。
3、溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。
6、pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含RNA酶20μg/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。
碱裂解发制备质粒DNA原理
试验原理：
碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺酸钠进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性（NaOH对细胞的裂解作用强于SDS）。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、pcr扩增、银染序列分析等。
实验前方法/试剂的选择
首选方法是碱裂解法。如果有问题，或者是大质粒(>15 kb)，则用温和的方法SDS裂解法。详细情况见“分子克隆”。试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。
关于碱裂解法
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了(电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。)。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。（似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能100%配对复性）碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入NaOH/SDS液后，溶液在1分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。
5、微量离心机上以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。
6、上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4℃，12000rpm,离心5min。{经验之谈：如果选用宿主合适的话（如DH5a、XL1-red等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切、转化完全没有问题。仅供参考}
11、小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核酸沉。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。
12、加入50μlTE缓冲液（PH 8.0含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。
所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点：如何去除RNA，如何将质粒与细菌基因组DNA分开，如何去除蛋白质及其它杂质。
去除RNA相对比较简单，首先是使用RNase消化(抽提中或者抽提后)。经过RNase消化后，RNA变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。如果要彻底去除残留得RNA，则需要更烦琐的操作。
2、沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置10min。
3、加入200μl溶液II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min。
4、加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min。
溶液III中各成分的作用
溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了，所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。得到的质粒样品一般用含RNase（50ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环(环装质粒一条单链发生缺刻)这三条带（泳动速度:共价闭合环状>线性>开环）。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100 kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
7、70%乙醇
试验步骤:
1、无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以4000rpm离心5－10min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。
7、小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。
8、小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍体积异丙醇,混匀,4℃离心12000g×5min。
9、上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min－10min，以12000rpm,离心5min-15min。
10、1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1～2次,沉淀在室温下晾干。