（4）米氏常数
Km值的改变主要是由于载体与底 物间的静电相互作用。当两者所带电 荷相反时，载体和底物之间的吸引力 增加，从而使酶的Km值减小；当两者 电荷相同时，载体与底物之间相互排 斥，使酶的Km值增大。
（5）最大反应速度
固定化酶的最大反应速度 与游离酶多数是相同的。
第四节 固定化酶的 催化反应机理探讨
一、酶固定化技术发展史
20世纪70年代初，千畑一郎采用有效载体 在温和条件下将整个微生物菌体固定化并 连续生产L-天冬氨酸。 1978年，日本的铃木用固定化枯草杆菌生 产α－淀粉酶 ，开始了用固定化活细胞进 行酶的生产先例。
一、酶固定化技术发展史
我国固定化酶的研究开始于1970年。

在染料工业将β－硫酸酯乙砜基苯胺引入固定 化领域，用于多糖载体与多种酶共价结合；
四、交联法
●酶分子 （a）酶分子之间用双功能基团 的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固 定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载 体上形成水不溶性的固定化酶
四、交联法
交联剂有形成希夫碱的戊二醛，形 成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应 的双重氮联苯胺或N，N’－乙烯双马来 亚胺等，其中戊二醛最为常用。 参与交联反应的酶蛋白的功能基团 有氨基、酚基、巯基和咪唑基等。
二、影响固定化酶的动力学因素
游离酶经固定化后所引起的酶性 质改变，归纳起来有下列几种原因：
• 酶分子构象的改变 • 载体的屏蔽效应 • 微环境的影响 • 扩散效应
二、影响固定化酶的动力学因素
（1）酶分子构象改变的影响 酶分子在固定化过程中发生了某种 扭曲，使酶分子拉长，改变酶活力部位 的空间结构，从而改变酶的活力。
固定化酶在操作中可以长时间 用共价键结合法制备的固定化 保留活力。一般情况下，半衰期在 青霉素酰化酶在37℃参与反应77天 一个月以上，即有工业价值。 后残余活力仍为100％。
（2）储藏稳定性
固定化酶的储藏稳定性一般高于 游离酶，但如长期储存，酶活力也会 下降。固定化酶制成后最好立即使用。
（3）热稳定性
热稳定性对于工业应用极为重要。 多数酶固定化后的热稳定性都较游离 酶高，但有一些酶的耐热性反而下降。
（4）对蛋白酶的稳定性
酶经固定化后，对蛋白酶的抵抗力提 高。可能因为蛋白酶是大分子，由于受到 空间位阻的影响，不能有效接触固定化酶。 固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的 耐受性也得到了提高。
（5）酸碱稳定性
固定化5’－磷酸二脂酶生产单核苷酸； 固定化青霉素酰化酶生产6－氨基青霉烷酸 （6-APA）和固定化葡萄糖异构酶生产果葡糖 浆等，成功用于工业化生产。


一、酶固定化技术发展史
近年来，各国已从早期集中于各 种固定化酶制备方法的研究转向酶在 固定化后作用机制以及在工业、医学、 化学分析、亲和层析、环境保护、能 源开发等方面的应用研究。
多数固定化酶的酸碱稳定 性高于游离酶，体现在其反应 最适pH范围变宽。
（三）固定化酶的反应特性
固定化酶的反应特性，例如，底 物特异性、反应的最适pH值、反应的 最适温度、动力学参数、最大反应速 度等均与游离酶有所不同。
（1）底物特异性
固定化酶的底物特异性与底物 量的大小有一定关系。 分子糖化酶固定化后，对分子量 8000 当酶的底物为小分子化合物时， 的直链淀粉活性为游离酶的 70％，对 固定化酶的底物特异性大多数情况 子量为500000的直链淀粉的活性 下不发生变化，而当酶的底物为大分 15分子化合物时，固定化酶的底物特 －17％。 异性往往发生变化。
（2）反应最适pH值
酶经固定化后，其最适pH和pH曲 线常会发生偏移。最适pH和pH曲线的 变动取决于酶蛋白和水不溶性载体的 电荷性质。有些酶在固定化后最适pH 发生变化，而pH曲线不变。
（3）反应的最适温度
固定化酶的最适反应温 度多数较游离酶高，但也有 不变甚至降低的。
（4）米氏常数
米氏常数表明了酶与底物 的亲和力。固定化酶的Km与游 离酶的Km有差异。
一、吸附法
原理：吸附法是通过载体表面 酶与载体之间的亲和力是范 和酶分子表面间的次级键相互作用 德华力、疏水相互作用、离子键 而达到固定化目的酶的方法。和氢键等。
一、吸附法
优缺点：吸附法处理条件温 和，酶活力部位不易被破坏，酶 和载体结合力较弱，易于脱落。
一、吸附法
1.物理吸附法
通过物理方法将酶直接吸附 常用的无机载体有活性炭、多 孔 在水不溶性载体表面上而使酶固 璃等；有机载体有淀粉、谷蛋 定化的方法称为物理吸附法。玻 丁基或己基－葡聚糖凝胶等。
四、交联法
优缺点：此法制备的固定化酶结 合牢固、不易脱落。但由于反应条件 比较激烈，固定化酶活力回收率一般 比较低（30％左右）。
各种固定化方法的特点比较
吸附法
制备 结合程度
包埋法 共价键 交联法 结合法 物理吸附法 离子吸附法
易 弱 可能 低 易 中等 高 可能 低 不变 较难 强 高 低 不变 难 强 低 高 可变 较难 强 中等 中等 可变
活力回收率 易流失 再生 费用
不可能 不可能 不可能
底物专一性 不变
无载体固定化
无载体固定化就是在无外来惰性 载体的情况下固定化酶的方法。
无载体固定化
无载体固定化酶的优点： 无载体固定化酶不溶于水也不溶 于有机溶剂，回收方便。 固定化酶本身为高浓度酶的聚合 物，有较高的催化剂表面积，一 般具有较高的催化活性。
第四节 固定化酶的催化反应机理探讨
从游离酶到固定化酶是一个很 大的改变，这一转变给酶催化反应 动力学带来了显著而复杂的影响。 从反应工程方面分析，固定化酶反 应系统属于非均一催化反应。
一、固定化酶对反应体系的影响
固定化酶的性质许多不同于水 溶性酶。这些变化是因为固定化对 酶本身和反应体系产生了影响。
无载体固定化
无载体固定化酶的优点： 稳定性高，对高温、有机溶剂等 有很高的耐受性，对外源蛋白酶 的水解有很强的抗性。 固定化酶具有较大的孔径结构， 使溶剂、底物和产物的扩散阻力 小甚至可以忽略。 制备简单，成本较低。
无载体固定化
无载体固定化酶的种类：
交联溶解酶 交联酶晶体 交联酶聚集体 交联喷雾干燥酶
酶的固定化
酶 可溶 固定化
间歇
吸附 包埋 交联 连续 化学偶联
间歇
第一节 固定化酶的定义及特点
一、酶固定化技术发展史
1916年Nelson和 Griffin发现酶不溶于水而 具有酶活性现象。 1948年Summer把刀豆脲酶制成非水溶性酶， 同样具有酶活力。
1953年由Grubhofer等采用聚氨基苯乙烯树脂 重氮化法实现了羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶 和核糖核酸酶等的固定化。
一、固定化酶对反应体系的影响
对液体酶反应，酶浓度为10－2mol/L时， 酶与底物间最大平均间距为20nm。对于固 定化酶反应，若固定化酶颗粒直径为0.1mm （100μ）时，则与粒子距离最近的底物与 酶的距离为20μ，为液体酶的1000倍。 因此，固定化酶反应的物质传递对反应 速度的影响变的更加重要。
二、包埋法
1.网格型 常用的固定化载体有聚丙 烯酰胺、聚乙烯醇等高分子化 合物，以及淀粉、明胶、卡拉 胶等天然高分子化合物。
二、包埋法
2.微囊型 这类固定化酶通常为直径几 微米到几百微米的球状体，颗粒 比网格型小，有利于底物和产物 的扩散，但是反应条件要求高， 制备成本也高。
二、包埋法
2.微囊型 制备微囊型固定化酶有如下方法： 界面沉淀法 界面聚合法 二级乳化法 液膜法（脂质体包埋法）
（一）酶活力
酶经固定化后，活力大部分下降。 1.酶活性部位的重要氨基酸残基与 水不溶性载体结合； 2.酶与不溶性载体结合时，它的结 构起了变化； 3.酶被固定化后，酶与底物的相互 作用受到空间位阻的影响。
（二）固定化酶的稳定性
固定化酶的稳定性一般要比游 离酶提高很多，有利于工业生产。
（1）操作稳定性
二．固定化酶的定义
固定化酶是指在一定的空间 范围内起催化作用，并能反复和 连续使用的酶。
三、固定化酶的特点
固定化酶与游离酶化后稳定性提高。 固定化酶催化的反应过程更易控制。 固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅 拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶 催化反应的连续化和自动化操作。 固定化酶与游离酶相比更适于多酶体系。
一、吸附法
1.物理吸附法 此法具有酶活力部位及其空间 构象不易被破坏的优点，但酶附着 在载体上，存在易于脱落等缺点。
一、吸附法
2.离子吸附法 离子吸附法是将酶与含有离 载体有多糖类离子交换剂和合 子交换基团的水不溶性载体以静成高 子离子交换树脂。例如：DEAE-纤 电作用力相结合的固定化方法，分 、CM－纤维素、纤维素－柠檬酸 即通过离子键使酶与载体相结合素 的固定化方法。
三、共价键结合法
与载体共价结合的酶的功 能基团包括：氨基；羧基；苯 环；巯基；羟基；咪唑基；吲 哚基；酚基等。
三、共价键结合法
三、共价键结合法
三、共价键结合法
三、共价键结合法
三、共价键结合法
共价键结合法可分为： 重氮化法 烷基化和芳基化法 溴化氰法 叠氮法
四、交联法
原理：交联法是使用双功能 试剂或多功能试剂与酶分子间进 行交联的固定化方法。
第六章 固定化酶和 固定化细胞
为什么要固定化酶
游离酶催化反应存在如下缺点： 游离酶催化反应几乎都在水溶液 中进行，只能一次性使用，难以 回收 酶与产物混合，增加了酶分离和 纯化的难度 溶液中酶的稳定性差，容易变形 和失活


酶的固定化
将游离酶、细胞或细胞器等 的催化活动完全或基本上限制在 一定空间内的过程称为固定化。
四、固定化酶的制备原则


必须注意维持酶的构象，特别是活性中 心的构象。 酶与载体必须有一定的结合强度。 固定化酶应有利于自动化、机械化操作。 固定化酶应尽量减小空间位阻。 固定化酶应有较高的稳定性。 固定化酶的成本适中。