第五章分子生物学研究方法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术5.1 重组DNA技术重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）又称遗传工程，在体外重新组合脱氧核糖核酸（DNA）分子，并使它们在适当的细胞中增殖的遗传操作。
重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。
特点：不受亲缘关系限制，为遗传育种和分子遗传学研究开辟了崭新的途径。
适用于获取目标基因的表达产物。
5.2 DNA基本操作技术（1）核酸凝胶电泳技术将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。
某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA 和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。
将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
适用于DNA、RNA片段的分离。
缺点：紫外对DNA分子有损伤，染料毒性大。
（2）细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。
提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，接受转化DNA 的细菌菌株被称做受体菌株。
常用的方法：CaCl2法和电击法大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。
在加入转化DNA之前,必须先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态(Competent Cells)，Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用。
转化载体上一般带有LacZ基因，常用带有不同抗生素的选择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。
（3）聚合酶链反应技术用于体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。
反应体系：模板DNA、PCR引物、四种核苷酸、Mg2+、TaqDNA聚合酶、缓冲液和超纯水。
反应过程：DNA解链（变性）、引物和模板相结合（退火）和DNA合成（链的延伸）特点：敏感，特异，快速的核酸分析技术（4）实时定量PCR荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
适用于对目标DNA片段初始浓度的定量分析。
优点：与常规PCR相比，其特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等缺点：实验成本较高，影响因素较多，在定量丰度低的不可培养微生物时，其准确性不强。
（5）基因组DNA文库构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆，汇集这些克隆的总汇称为基因组DNA文库。
可用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。
常用λ噬菌体载体，简单快速、易于操作。
5.3 RNA基本操作技术（1）总RNA的提取总RNA包括mRNA、rRNA、tRNA和一些小RNA（sRNA）总RNA抽提方法很多，常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法。
RNA的浓度和纯度可以通过测定OD260/OD280来判定，1.8-2.0在表示提取的RNA纯度较好。
在变性的条件下进行RNA的电泳，甲醛是常用的变性剂，电泳后如果rRNA 大小完整，而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2:1，mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。
（2）mRNA的纯化真核细胞的mRNA分子结构特征是具有5’端帽子结构-m7G和3’端的polyA 尾巴。
实验常用寡聚（dT）-纤维素柱色谱法获得高纯度mRNA。
就是利用mRNA3’端polyA的特点。
mRNA在高盐缓冲液下会特异性结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。
目前许多商业化的试剂盒可用于mRNA的纯化，如Promega公司的polyATTract mRNA分离系统将生物素标记的寡聚dT引物与细胞总RNA温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合polyA mRNA，通过磁场吸附作用将polyA mRNA从总RNA中分离。
（3）cDNA的合成cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。
第一链是以mRNA为模板。
有反转录酶（oligo dT）催化反转录成cDNA。
第二链的合成是以第一链为模板，由聚合酶催化合成。
反应体系中加入甲基化dCTP，保证新和成的cDNA链被甲基化修饰，以防止构建克隆时被限制性内切酶切割。
一般合成的cDNA双链5’端和3’端分别具有Eco RI和Xho I粘性末端，保证它与载体相连时有方向性。
（4）cDNA文库的构建常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足cDNA文库的要求，载体的选择要根据该文库的用途来确定。
常用的载体是Uni-zap XR载体。
文库的构建可用于筛选目的基因、大规模测序、基因芯片杂交等功能基因组学研究。
cDNA文库的特点：基因特异性、器官特异性、代谢或发育特异性、不均匀性和各cDNA均可获得表达缺点：包含的遗传信息少于基因组DNA文库，并受细胞来源和发育期的影响；cDNA能反映mRNA分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构和功能方面的信息；低丰度mRNA的cDNA克隆难于分离。
（5）基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程。
①核酸杂交法用放射性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落杂交筛选。
特点：适用性广泛、快速。
②PCR筛选法适用于已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。
特点：通用性强、操作简单。
③免疫筛选法适用于表达文库的筛选。
特点：基于抗原抗体结合原理，操作简单。
5.4 SNP理论与应用SNP（单核苷酸多态性）指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。
染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。
SNP 是最简单、最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。
根据SNP在基因组中的分布位置：同义cSNP：不影响氨基酸序列。
基因编码区SNP（cSNP）非同义cSNP：改变碱基序列。
SNP分为基因调控区SNP（pSNP）基因间随机非编码区SNP（rSNP）SNP检测技术：①基因芯片技术优点：高通量，一次可对多个SNP进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。
缺点：芯片设计成本高，由于DNA样品的复杂性，有些SNP不能被检出。
②Taqman技术优点：操作简单。
可自动化。
缺点：不能高通量分析，荧光探针费用高。
③分子信标技术与Taqman技术相似，也是在PCR体系中加入荧光标记的探针与靶序列杂交，通过检测荧光值的变化进行基因分型。
优点是操作简单，课自动化；缺点是探针费用高，不能高通量分析。
④焦磷酸测序法适用于已知序列的DNA片段进行验证分析，已知SNP的序列验证及基因分型。
优点：自动化程度高，通量大，速度快，易于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。
缺点：能读取的DNA长度有限。
5.5 基因克隆技术在分子生物学中，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程称为克隆①RACE技术适用于扩增已知cDNA序列的基础上克隆5’端或3’端缺失序列。
优点：简单、快速、廉价等缺点：很大程度上依赖于RNA连接酶连接和寡聚帽子的快速扩增。
②应用cDNA差示分析法克隆基因适用于在没有探针的情况下克隆控制某一特定性状或生理反应中间步骤的基因。
优点：快速简便。
mRNA用量少，大大降低了假阳性率，PCR产物特异性较高，cDNA片段的纯度较高。
③Gateway大规模克隆技术利用λ噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。
优点：克隆重组率高；简单快速，可自动化；保持阅读框和方向；一次实验可以转移一个或多个基因到一个或多个表达载体。
④基因的图位克隆法适用于分离未知性状目的基因特点：无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
需要构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。
5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术（1）双向电泳技术用于分离大量混合蛋白质组。
优点：操作方便，可自动化。
缺点：低拷贝蛋白的检测受限；难于分离极酸或极碱蛋白以及分子量极大或极小蛋白；难溶蛋白的检测较困难；技术要求较高。
（2）蛋白质印迹法用于检测样品中是否存在蛋白抗原、基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断。
优点：高效、简便、灵敏等。
（3）蛋白质的质谱分析技术用于鉴定不同的蛋白质，特别适合于对未知肽的检测。
优点：灵敏度高、分辨率高、需要的样品量少、快速，信息量大缺点：实验成本高，难解决细胞组织痕量调控蛋白游离显示的问题。