polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，
按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已
经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及研
究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。
琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由β-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合形成
的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却
时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼
PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右
±äÐ Ô 90¡ «95¡ æ
70¡ «75¡ æ
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PCR指 数扩增时 循环次数 与DNA产 物数量的 比较。
PCR的基本原理
DNA 94 模板 温 DNA引物 dNTP 度 72 TaqDNA聚合 （℃） 酶 55
分离超大片段的DNA
5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖
细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株
的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。
•提供转化DNA的菌株叫作供体菌株；
•接受转化DNA的细菌菌株称为受体菌株。
大多数细菌，正常条件下转化效率很低。
为了高效转化这些细菌，必需对受体细菌进行一些理
•琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为 0.2~50kb之间。 •聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱 基对之间。 •凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小， 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。
在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色
，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷
50℃ 95℃
引物1
PCR的基本原理
Taq酶
DNA引物
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
50℃ 72℃
引物1
引物2
Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
72℃ 95℃
第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 Taq PCR的特点
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中 加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的 方法。
在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达 设定的域值时所经历的循环数。
荧光染料SYBR Green Ⅰ探针的实时定量PCR
题；
② 50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交 替问题； ③ 50年代末至60年代，提出了“中心法则”和操
纵子学说，阐明了遗传信息的流动与表达机制。
重组DNA技术史上的主要事件
（GMO转基因生物）
2003 美国科学家完成狗基因组全序列测定 2004 中国科学家完成家蚕基因组全序列测定 2005 中、美、日科学家联合完成水稻基因组序 列测定
地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使
每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 ，也可
以被清晰地检测出来。
EB（Ethidium bromide，溴化乙锭），分子式：
C21H20BrN3，熔点：260 - 262°C ，是一种高度灵敏
的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中
的DNA。
溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙 红色信号，可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶 成像处理系统拍摄。 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是
重组DNA操作过程：
获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂
种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细
菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛
选，获得DNA重组表达。 并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式 从细胞中被分离纯化出来。
重组DNA实验中常见的主要工具酶
5. 2 DNA操作技术 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（
第4轮扩增 第5轮扩增
实际拷贝数=(1+x)n
X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
PCR引物设计
① 一对引物，与3′端互补 ② 长度：15～30个核苷酸
③ 碱基分布随机
④ 引物内、引物间不应有互补序列
⑤ 引物与非特异扩增区无同源性
⑥ 3′端必须互补 ⑦ 5′端可游离
5.2.4 实时定量PCR （Real-time Quantitative PCR） 实时定量PCR是20世纪90年代中期发展起来的基于 PCR技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术 。具备了传统PCR的优点，又克服了传统PCR的许多 缺点。
培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂
布于选择性培养基中分离转化子。
电击法是细菌转化的另一种高效法： 由于转化载体上一般带有LacZ基因（大肠杆菌编码 β-半乳糖基酶），实验室常用带有不同抗生素的选 择性培养基结合α-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞 。 感受态细胞转化频率的计算方法为： •转化体总数=菌落数×（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积） •插入频率=白色菌落数/(白色菌落数+蓝色菌落数 ） •转化频率（每μgDNA转化菌落数）=转化体总数 /加入质粒DNA总量(μg）。
强诱变剂,具有高致癌性!
EB可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。
1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发， 挥发至空气中，危害很大。 2 废 EB溶液的处理方法 (1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入 等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 (2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放 置1小时； b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 3 废EB接触物，如抹布，枪头。 一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。
λ噬菌体作 为克隆载 体构建基 因流 程图细菌转化及蓝白 斑筛选
蓝白斑筛选是重 组子筛选的一种 方法： 含空载体的菌 落为蓝斑； 含外源DNA的 菌落为白斑； 未转化的细菌 不能在抗性培养 基上生长。
5.2.3 聚合酶链反应技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR) 是1985年问世的一种体外扩增DNA片段的技术。 首先将双链DNA分子加热分离成两条单链，DNA聚 合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种 dNTP合成新生的DNA互补链。 因为DNA聚合酶需要有一小段双链DNA来启动（“ 引导”）新链的合成，所以，新生DNA链的起点由 一小段寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点 所决定。
72℃ 50℃ 95℃
Taq
Taq
Taq
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
72℃
第2轮结束
第1轮扩增 模板DNA 第2轮扩增
PCR反应条件 PCR过程 第 3轮扩增 PCR的特点
重复30轮后 30 2 =1,073,741,824
第6轮扩增 理想拷贝数=2n
n 循环次数
2005 美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基
因组全序列测定
限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定 碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产 生具有粘性末端的小片段。
PCR反应的全过程，即三步，可以被不断重复：
•DNA解链（变性），
•引物与模板相结合（退火），
•DNA合成（链的延伸）。
经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链
DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段
的拷贝数，理论上的最高值应是2n。
PCR的主要步骤
将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（ >94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形 成单链模板DNA。 然后降低反应温度（约50℃），致冷1分钟，使寡 核苷酸引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结 合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。 最后，将反应混合物的温度上升到72度左右保温1数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加 入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向 延伸，合成新生DNA互补链。
应用TaqMan探针实时定量PCR技术
利用荧光染料SYBR Green Ⅰ可以检测PCR反应中 获得的全部双链DNA，但不能区分不同的双链 DNA。为了进一步确保荧光检测确实是靶DNA序 列，人们又设计了只能与目的DNA序列特异结合 的荧光探针，如TaqMan探针。 这种探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中 间部位结合的单链DNA（50-150bp）。随着PCR 反应进行，这种探针结合到目的DNA序列上，并 且会被具有外切酶活性的TaqDNA聚合酶逐个切除 而降解。被切下的荧光基团会在激发光下发出荧 光，荧光强度直接反映了扩增靶DNA的总量。
95℃
1
模板DNA 2 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
55
条变 单性 链
22 DNA双螺旋 1 2 3
时间（min）
DNA 2 DNA单链 与引物复性
子链延伸 DNA加倍
4
5
PCR的基本原理
DNA引 物
引物2
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点