实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:
硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
[试剂]
1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 242242
2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;
-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);
(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4
贮于棕色瓶中;
-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33
液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2
KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 242
7( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。
水溶后定容至100ml。
[方法];
1. 标准曲线制作:
管号 1 2 3 4 5 6 7
亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 4
0.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4
每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮(ug)为横坐标(X)，吸光值
为纵坐标(Y)建立回归方程。
2. 样品中硝酸还原酶活力测定
1. 在取材的前一天加50mmol/L KNO或NaNO到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。
33
2. 称取作物叶片0.5g(共3份，剪成1cm 左右的小段(均匀)，放入3只三角瓶中，其中
1份作对照，另外2份作酶活性测定用。
3. 反应:先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml
0.1mol/L KNO溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟(期间几次通入空气，再3
抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25?黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶(对照
瓶除外)加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
4. 比色测定:将各瓶摇匀静置2min后，各取2ml反应液，加入1ml磺胺，摇匀后再加入
1ml萘基乙烯胺，再在35?水浴中显色15min ，后比色，540nm 5. 空白溶
液:2ml蒸馏水+1ml磺胺+1mlα-萘胺。
同样和样液一样进行水浴15min。
结果计算
x，v1v2单位鲜重样品中硝酸还原酶活性[μg/ (g .h)] ,W，t
式中:为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，μg ;V为提取酶时加入的缓冲液体积，1
ml;V为酶反应时加人的粗酶液体积，ml;W为样品鲜重，g;t为反应时间，h。
2
二、谷氨酰胺合成酶的活性的测定
【原理】
2+ 谷氨酰胺合成酶(GS)是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。
在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ?谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。
谷氨酰胺合成酶活性可用产生的,1γ?谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol?mgprotein?h,,,111。
也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A?mg protein?h【仪器与用具】冷冻离心机;分光光度计;天平;研钵;恒温水浴;剪刀;移液管(2ml、1ml)。
【试剂】
提取缓冲液: 2+0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。
称取Tris(三羟甲基氨基甲烷)1.5295g，0.1245g MgSO?7HO，
0.1543g 42DTT(二硫苏糖醇)和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml;
反应混合液A(0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4):
2+内含80mmol/L Mg，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO?7HO, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g42 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml;
反应混合液B(含盐酸羟胺，pH7.4):
反应混合液A的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4;
显色剂(0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl和0.6mol/L HCl混合液): 3
3.3176g TCA(三氯乙酸)，10.1021g FeCl?6HO，去离子水溶解后，加5ml32
浓盐酸，定容至100ml;
40mmol/L ATP溶液:0.1210g ATP溶于5ml去离子水中(临用前配制)。
【方法】
1.粗酶液提取称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4?下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。
2.反应 1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37?下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心
10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。
3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质(见实验28)。
4.原始数据记载
结果计算:
A
,,11P，V，t GS活力(A?mg protein?h), 式中 A—540nm处的吸光值;
P—粗酶液中可溶性蛋白含量(mg/ml); V—反应体系中加入的粗酶液体积(ml); T—反应时间(h)。