1.常用工具 平皿、试管、接种针、接种环、接种 钩、培养箱等
第二节 真菌培养技术
一、基本条件
2.培养基 真菌营养要求不高，最适pH 4.0～6.0
常用的培养基:
培养基名称 沙氏培养基 放线菌酮-氯霉素琼脂 玉米粉吐温-80琼脂 马铃薯葡萄糖琼脂 尿素琼脂 心脑浸液葡萄糖血琼脂 显色鉴定培养基
培养基用途 真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌） 深部真菌培养 真菌的培养与鉴定
尿素分解试验 • 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素
第三节 真菌的鉴定方法
二、免疫学检查
皮肤试验
•
提取真菌抗原，进行皮内注射或斑贴试
验，观察注射或试验部位有无红肿硬结出现
血清学检测
•
检测真菌的抗原或抗体，例如：胶乳凝
集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、
放射免疫分析等
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
第一节 真菌形态检验技术
二、直接镜检
标本+标本处理液
（菌与其他 混杂物的鉴别
标本处理液： （1）KOH溶液 适于检查致密的难以透明的材料 （2）生理盐水 用于观察真菌的出芽现象 （3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液 透明力较强，只限于不透明的
标本
第一节 真菌形态检验技术
第二节 真菌培养技术
二、培养方法
试管培养法 多用于菌种传代接种与保存
大培养法
仅用于培养生长繁殖较快的真菌
小培养法
观察真菌结构及生长发育过程
玻璃棒 载玻片 培养基 盖玻片
无菌蒸馏水
第二节 真菌培养技术
三、生长现象
观察菌落 生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等
酵母型菌落
类酵母型菌落
l. 厚膜孢子形成试验
假菌丝
厚膜孢子
方法：
待测菌
接种
玉米粉吐温-80琼脂
25℃孵育1～3天
每天于显微镜下观察
结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假菌丝，假 菌丝顶端见1～2个厚膜孢子
应用：白假丝酵母菌的鉴定
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
芽管
2.芽管形成试验
方法：
待测菌+0.5～1ml血清 37℃水浴2～3小时
国家卫生和计划生育委员会规划教材
《微生物学检验》
第十四章 真菌检验技术
返回总目录
本章内容
1 第一节 真菌形态检验技术 2 第二节 真菌培养技术 3 第三节 真菌的鉴定方法 4 第四节 真菌药物敏感试验
学习目标及重点
学习目标： • 掌握真菌的检验方法 • 熟悉真菌标本采集及注意事项；真菌的鉴定程序；真菌药物
返回章内容
丝状菌落
第三节 真菌的鉴定方法
一、常用生化试验
糖（醇）类 发酵试验
• 检测真菌对单糖、多糖、醇类等发酵情况
同化碳源试验
• 检测真菌对糖类中的碳源利用能力的试 验，主要用于鉴定酵母菌
同化氮源试验
• 检测真菌对氮源利用能力的试验，主要用 于鉴定酵母菌
明胶液化试验
• 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋白 ，使其失去凝胶性质而不能凝固
第一节 真菌形态检验技术
2. 标本采集注意事项
标本来源要适宜 用药前采集标本 严格无菌操作 标本量要充足 立即送检
第一节 真菌形态检验技术
3. 检验程序
临床标本
直接检查
核免
形
酸疫
态
检学
学
测检
检
查
查
直接 镜检
染色 镜检
分离培养
观察菌落
镜生 其 检化 他
反鉴 应定
试 验
病理组 织标本
动物实验
PAS HE
待检菌液制备 用培养基稀释成1×103～5×103 CFU/ml
配成最高试验浓度的10倍（水溶性药物）
药物原液配制 或100倍（脂溶性药物）
药液稀释
以培养基依次作10倍稀释， 浓度范围：原液～10倍于试验终浓度
第四节 真菌药物敏感试验
2．方法
稀释药物
将药液加至无菌96孔微量板
各孔接种0.1ml工作浓度的菌液 35℃孵育48h（假丝酵母菌）或72h（ 新型隐球菌），观察结果
6. 真菌毒素的检测 色谱法等多种方法
7. G试验
用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断
返回章内容
第四节 真菌药物敏感试验
药敏试验目的
• 指导临床用药 • 监控耐药菌株的发生和耐药性变化 • 预期研究新药的潜在疗效
第四节 真菌药物敏感试验
一、临床常用抗真菌药物
据化学结构分类
• 多烯类：如两性霉素B、制霉菌素等 • 吡咯类：如酮康唑、伊曲康唑等 • 其他：如氟胞嘧啶
三、染色镜检
1. 革兰染色：各种真菌均为革兰阳性（图1） 2. 乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色（图2） 3. 墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色（图3） 4. 荧光染色：荧光显微镜下发出荧光 5. 糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色
（图1）
（图2） 返回章内容
（图3）
第二节 真菌培养技术
一、基本条件
第四节 真菌药物敏感试验
3．结果判断
据作用机制分类
• 作用于真菌细胞膜：如两性霉素B等 • 作用于真菌细胞壁：如尼可霉素Z等 • 干扰真菌DNA合成：如5-氟胞嘧啶等 • 其他：如大蒜新素及冰醋酸等
第四节 真菌药物敏感试验
二、酵母菌药敏试验方法——微量稀释法
1．试验前准备
培养基
RPMI 1640培养基 （含L-谷氨酰胺、酚红，不含碳酸氢钠）
第二节 真菌培养技术
显色鉴定培养基
原
代谢基质 产色基团
理
真菌的酶
分解代谢基质
真菌特异性酶的 底物（无色）
产色基团游离（ 显色）
第二节 真菌培养技术
白色念珠菌： 热带念珠菌： 克柔念珠菌： 光滑念珠菌： 近平滑念珠菌：
蓝绿色 蓝灰色、铁蓝色
粉红色 紫色 白色
SUCCESS
THANK YOU
2019/8/4
镜检
结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型的放大镜柄状芽管 应用：白假丝酵母菌的鉴定
第三节 真菌的鉴定方法
三、其它鉴定诊断方法
3. 动物接种
用于分离病原性真菌、确定真菌的致病性、研究 抗真菌药物
4. 病理组织检查 用于深部真菌感染的诊断
5. 核酸检测
用于真菌的分型鉴定
有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相
敏感试验方法 • 了解常用抗真菌药物 本章重点： ★临床真菌标本的采集和处理
★真菌的形态学检查、培养技术和鉴定试验 ★真菌药物敏感试验
第一节 真菌形态检验技术
一、标本的采集和处理
1. 标本的采集——根据真菌感染部位采集不同的标本
浅部真菌感染
取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本
深部真菌感染
取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本