第一节常规毒性试验一、急性毒性试验急性毒性试验是研究化学物质大剂量一次染毒或24h内多次染毒生物所引起的毒性试验。

其目的是确定化学物质的毒性程度以及剂量—反应关系，确定此化学物质与其他化学物质的相对毒性，确定具体的急性毒作用以及提供毒作用模式方面资料，并为进一步开展其他毒性试验提供理论依据。

一项设计合理的急性毒性试验，可以得到用以计算LD50的资料。

(一)水生生物急性毒性试验1．鱼类毒性试验鱼类急性毒性试验，是水生生态毒理学的重要内容之一，并广泛应用于水域环境污染监测工作中，对控制工业废水的排放，保护水域环境，发展渔业生产，制定渔业水质指标，具有重要意义。

(1) 试验用鱼的选择应具有代表性，便于在实验室条件下饲养的当地经济鱼类，对毒物敏感，个体健康。

短期试验多采用我国的青鱼、草鱼、鲢鱼及鳙鱼四大养殖淡水鱼，一般体长在7cm以下为宜。

也可采用金鱼，一般在3cm以下。

选择行动活泼、体色光泽、鱼鳍舒展完整、逆水性强和食欲好的当年鱼种，在实验室内驯化培养7—10天使用(2) 试验条件试验容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每条鱼2—3L为宜，水的PH值为6.5—8.0，冷水温度为12—18℃，温水温度为20—28℃，一次试验中水温变化范围为±2℃。

水中溶解氧不能低于4mg/L，可用清洁的河水、湖水或放置3天以上的自来水。

（3）半数致死浓度（LC50）的测定先做预备试验，确定100％致死浓度和不引起死亡的最大浓度，然后以此浓度范围，按等对数间距确定5-6个浓度组，另加一空白对照组，每组10-20尾鱼，染毒48-96h。

染毒刚开始8h内经常观察，以后可作24h、48h、72h、96h的定期观察，记录中毒反应及死亡时间。

死亡鱼立即取出剖检。

试验期间保持溶解氧、pH值、水温等条件的稳定。

根据24h、48h、96h各组鱼的死亡数，按LC50计算方法，求出相应时间的LC50 。

一般采用直线内插法或对数-概率模式法。

2．水蚤类急性毒性试验水蚤类是淡水生物的重要类群，水蚤对许多毒物很敏感。

早在100多年前，就有人用它来检测药物的毒性。

水蚤类的世代周期短，实验室易培养，产仔量较多，是一类很好的试验生物。

由于该试验装置简单，省人力，故在水毒理学研究上广泛应用。

大型水蚤(Daphnia magna Straus)是水蚤属中个体最大的种类，系水蚤类毒性试验的标准生物，试验用水蚤一般为孤雌生殖新生蚤(<24h)。

详细试验方法可参照美国公共卫生协会等编著的《水和废水标准检验法》。

1.种子发芽和根伸长的急性毒性试验本方法可用于测定受试物对陆生植物种子萌发和根部伸长的抑制作用，以评定受试物对陆生植物胚胎发育的影响。

原理种子在含一定浓度受试物的基质中发芽，当对照组种子发芽率在65％以上，根长达2cm时，试验结束，测定不同处理浓度种子的发芽率和根伸长抑制率。

仪器和试验材料培养容器，受控环境生长箱，试验材料可选用小麦、水稻、大白菜、番茄、棉花等。

每一植物种子试验，至少应有6个不同的处理浓度。

浓度以几何级数选择。

每一处理浓度应设3次以上重复，每一重复至少15粒种子。

发芽试验期间温度控制在(25±1) ℃，保持黑暗。

对照组种子发芽率达到65％以上．根的长度达2cm，试验即可结束。

测定各处理浓度发芽和根伸长长度的平均值。

若得不出发芽率和根伸长的EC10和EC50，应重新进行试验。

注意事项本测试适用于水溶性化学物质，如果受试物不溶于水，可用水溶性有机溶剂，如丙酮、乙醇、丙醇等作载体，获得试验要求的浓度。

发芽是指胚重新开始活跃生长。

种子初生根的长度达0.5cm作为发芽的标准。

种子应大小一致，饱满度、等级相同。

所有试验用的玻璃器皿和基质应清洁，无污染。

试验中不准使用塑料培养皿。

对照种子发芽率应大于65％。

(三) 蚯蚓的急性毒性试型蚯蚓急性毒性试验的目标是评价环境中化学物质，如农药和有毒有机污染物对土壤中动物的急性伤害。

常用的蚯蚓品种是赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)，因其生活周期短，繁殖能力强，易于饲养已被作为土壤环境污染生态毒理诊断的试验用物种。

尽管赤子爱胜蚓不是典型的土壤种类，但它存在于富含有机物质的土壤中，对化学物质的敏感性与栖息在一般土壤中的蚯蚓类似。

蚯蚓急性毒性试验可分为滤纸接触毒性试验和人工土壤试验。

滤纸接触毒性试验简单易行，可对受试生物毒性进行初筛。

将蚯蚓与湿润滤纸上的受试物接触，测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响；人工土壤试验系将蚯蚓置于含不同浓度受试物的人工配制土壤中，饲养7天和14天，评价其死亡率。

应包括使生物无死亡急性毒性试验结果用美国国家环保局环境监测研究室进行生态监测时使用的TSK统计程序进行LC50计算。

(一)亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验是研究试验动物在多次给以受试物时所引起的毒性作用，试验期通常为动物生命期的1/30~1/10，大鼠一般为3~6个月，狗为4~12个月。

其目的是为了进一步研究受试物有无蓄积作用，试验动物对该物质能否产少耐受性，初步估计出现毒性作用的最小剂量和不出现毒作用的最大剂量。

通过亚慢性试验确定是否要进行慢性毒性试验，并为慢性毒性试验选择剂量提供参考。

下面以哺乳动物为例介绍亚慢性毒性试验程序。

1．试验动物及分组亚慢性试验中试验动物的种属和品系，应当是急性毒性作用试验证明的对受试物敏感的动物种属和品系，同时还应考虑与慢性毒作用试验中预计使用的动物种属和品系相同。

一般要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种，以便更全面地了解受试物的毒效应。

试验时选用健康、年幼的动物，大鼠各处理组不少于20只；家兔，猫，狗等较大动物，每组不应少于4—6只，雌雄各半。

至少设3个剂量组和一个对照组。

2．染毒剂量及实验期限适宜的剂量为：高剂量组能够引起明显中毒反应，但不引起很多动物死亡；低剂量组不引起任何中毒反应；介于二者之间的为中间剂量组。

另设一组对照组。

一般用LD50(LC50)的1/80~1/50作为亚慢性试验剂量。

试验期限随目的和要求动物种类不同而异，大鼠可90天，较大的动物可4~6个月。

3．染毒途径亚慢性毒性试验中接触外来化合物的途径，应尽量模拟人类在环境中实际接触的方式或途径，此外还应与预期进行慢性毒作用试验的接触途径相一致。

亚慢性试验中动物接触外来化合物的途径，主要是经胃肠道(经口)，呼吸道及皮肤接触。

4．观察指标（1）一般综合指标观察动物的一般活动、症状和死亡的情况，每周称重一次，记录饲料或饮水量，计算生长率(各组每周摄人食量与体重增加量之比)，并计算脏器湿重与单位体重的比值(脏器系数)。

（2）血液及生化检验主要指血清和肝、肾功能的检验。

常规项目包括血红蛋白、红细胞数、白细胞数、血小板数、谷草转氨酶、血清尿素氮等。

(3) 病理组织学检查在外来化合物的亚慢性毒作用试验中应重视病理组织学检查，必要时还可进行组织化学和电镜检查。

试验过程中解剖死亡或濒死动物。

试验结束时，处死所有动物进行尸检。

如未见明显病变，可将高剂量组和对照组的主要脏器进行病理学检查，发现病变后再对较低剂量相应器官组织进行检查。

特别注意肝、肾、睾丸等器官。

（二）慢性毒性试验慢性毒性试验是指以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试验动物所产生的生物学效应的试验。

所谓长期，是指试验动物整个生命期的大部分或终生，有时可包括若干代的试验。

通过慢性毒性试验，可确定最大无毒作用剂量，为制定人体每日允许摄入量和环境最高容许浓度提供毒理学依据。

三、蓄积毒性试验(一)蓄积系数法蓄积系数法是一种常用来评估环境污染物蓄积作用的方法。

所谓蓄积系数是分次给受试物后引起50％受试物出现某种毒效应的总剂量(以∑LD50(n)表示)，与一次给受试物后引起50％受试动物出现同一毒效应的剂量(以LD50(1) 表示)的比值，即K= ∑LD50(n) /LD50(1)比值愈小，表示蓄积作用愈强。

根据蓄积系数大小，可将环境污染物的蓄积作用强度分为以下几级，如表3.2所示。

表3.2 蓄积作用强度分级测定蓄积系数有下列两种试验方法：固定剂量每天连续染毒法和剂量定期递增染毒法。

1．固定剂量每天连续染毒法对受试动物以l/10-1/20LD50的固定剂量，每天进行染毒一次，观察记录动物死亡情况，当染毒剂量累计达到5个LD50（1）以上时，若受试动物死亡数未超过半数，此时的蓄积系数已大5，表明该受试物的蓄积作用不明显。

如果染毒过程中动物相继死亡，记下受试物出现50％死亡时累计的染毒总剂量，按上述算式计算蓄积系数。

2．剂量定期递增染毒法取动物20只，每天染毒一次，4天为一期。

开始的第一期每天染毒的剂量为0.1LD50(1) ，以后染毒剂量按等比级数1.5倍逐期递增一次，计算得出定期给予的剂量数(表3.3)。

在试验过程中，逐日记录动物的死亡情况，若连续染毒已达20天．此时每天的染毒剂量达0.5LD50，累计总剂量达5.30 LD50，如果受试动物死亡未达50％，则表示该受试动物的蓄积作用不明显，试验终止。

如果受试动物出现死亡达50％时，此时的累计染毒总剂量就是所求的蓄积系数。

依据试验求得的蓄积系数值，与蓄积系数强度分级比较，即可对受试动物的蓄积作用作出评估。

（三）受试物生物半衰期测定法生物半衰期(T1/2）是指一种外来化合物在体内消除到原有浓度的50％所需要的时间。

因此，生物半衰期越长的物质，表示越不易由生物体内消除，其蓄积作用的可能性就越大。

因测定外来化合物在生物体内的生物半衰期过程较为复杂，所以在实际观测中常常仅以间接测定其在血液、尿液或器官组织中原有浓度降低一半所需要的时间，以代表该物质的生物半衰期。

其方法是生物体接触受试物后，在一定间隔时间内分别测定血液或尿液、器官组织中该物质的浓度，依据所得结果按下式求出它的生物半衰期。

式中，y1和y2分别为给受试物后于t1和t2时间测得该物质的浓度或量。

根据测得的生物半衰期的长短，可以判定受试物的蓄积作用。

生物半衰期越长蓄积作用越大，反之则越小。

四、毒性试验的方式及其标准化(一)生物测试的定义生物测试(bioassay)指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物单独或联合存在条件下，所导致的影响或危害。

所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落-生态系统各级水平上的反映。

仅靠化学和物理的检测不能全面地评定污染物对生态系统的影响。

毒物或污染物的生物测试常被称为毒性试验。

生物测试方法简单，不需要特殊仪器设备，又能综合反映污染物对生态系统的影响或污染状况，因而被广泛采用。

毒性试验对于监测环境质量的变化，确定单一污染物的安全浓度，研究多种污染物联合作用的生物效应，制定污染物或废水的排放标准、环境质量标准以及污染物的生态风险评价等均有重要的价值。

（二）毒性试验的方式1．毒性试验的分类毒性试验的方式很多，根据毒性试验所经历的时间长短可以分为短期毒性试验，中期毒性试验和长期毒性试验。