木瓜蛋白酶性质测定
一、实验目的
1、学习并掌握木瓜蛋白酶活性测定的基本原理。
2、掌握影响木瓜蛋白酶性质的不同因素，如激活剂(如EDTA、半胱氨酸)，抑制剂、pH 等。
二、实验原理
木瓜蛋白酶（Papain）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。
它也具有脂酶活力。
其分子量约为23 000 左右。
木瓜蛋白酶是单条肽链，由211个氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和 EDTA等；抑制剂有巯基试剂，包括重金属、羧基试剂和过氧化氢等。
酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275 nm 处有吸收峰，根据测定275 nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
三、仪器和试剂
1、市售木瓜蛋白酶；
2、仪器设备：磁力搅拌器（机）；离心机7000rpm（冷冻式）；紫外分光光度计；水浴槽；冰箱及常规玻璃仪器。
四、实验步骤
（一）激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响
1、试剂
（1）3 mg·mL-1 木瓜蛋白酶液（用 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液，pH 7.2 配制）；（2）0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液，pH 7.2 ；
（3）激活剂：用 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制含10 m mol·L-1半胱氨酸，分别含有0，0.2，0.6，1.0，2.0，4.0 m mol·L-1EDTA 的6 种混合液；（4）1%酪蛋白溶液：用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.2）配制；
（5）15%三氯乙酸（TCA）溶液。
2、方法
EDTA 浓度
（mmol·L-1）
0 0.2 0.6 1.0 2.0 4.0
管号0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1
酶液（mL）0.2
0.2 0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
EDTA（mL） 1.8
1.8 1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8
1.8 37 ℃水浴预热10 min
1%酪蛋白（mL）0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0
37 ℃水浴10 min
TCA（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
1% 酪蛋白
（mL）
1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀，静置5 min 过滤（或离心）
A
275nm
0 2.028 0 2.036 0 2.055 0 2.137 0 0.578 0 0.082
（二）抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响
1、试剂
配制浓度分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mmol·L-1的过氧化氢溶液。
2、方法
过氧化氢浓度
（mmol·L-1）
0 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0
管号0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1
酶液（mL）0.2
0.2 0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
过氧化氢（mL）0.2
0.2
0.2 0.2 0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
37 ℃水浴预热10 min
1%酪蛋白（mL）0
1.0
0 1.0 0
1.0
1.0
1.0
1.0
37 ℃水浴10 min
TCA（mL） 2.0
2.0 2.0 2.0 2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
1% 酪蛋白（mL）1.0
1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀，静置5 min 过滤（或离心）
A
275nm
0 1.595 0 1.505 0 1.500 0 1.445 0 1.035 0 1.330
（三）不同pH 值对木瓜蛋白酶活力的影响
1、试剂
pH 5.0 缓冲液0.1 mol·L-1乙酸－乙酸钠缓冲液；
pH 6.0 缓冲液0.1 mol·L-1磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液；
pH 7.0 缓冲液0.1 mol·L-1磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液；
pH 8.0 缓冲液0.1 mol·L-1磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液；
pH 9.3 缓冲液 0.1 mol·L-1硼砂－氢氧化钠缓冲液；
2、用以上缓冲液分别配制不同pH 值的激活剂（1 m mol·L-1EDTA）和1%酪蛋白溶液。
缓冲液pH 5.0 6.0 7.0 8.0 9.3
管号0 1 0 1 0 1 0 1 0 1
酶液（mL）0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
0.2 0.2
0.2
0.2 0.2
EDTA（mL） 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
1.8 1.8
1.8
1.8 1.8
37 ℃水浴预热10 min
1%酪蛋白（mL ）
0 1.0
0 1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 37 ℃水浴10 min TCA （mL ） 2.0 2.0
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 1% 酪蛋白（mL ）
1.0 0
1.0 0 1.0 0 1.0 0 1.0 0
摇匀，静置5 min 过滤（或离心）
A 275nm 0 0.034 0 0.011 0 0.113 0 0.043 0 0.023 五、实验结果分析
1、各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。
2、做好实验曲线绘制及数据记录。
3、对该实验有哪些体会。
1.答：激活剂（EDTA ）对木瓜蛋白酶活力的影响
EDTA 浓度 （mmol·L -1）
0 0.2 0.6 1.0 2.0 4.0 管 号 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 A 275nm 0 2.028 0 2.036 0 2.055 0 2.137 0 0.578 0 0.082
抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响
过氧化氢浓度 （mm ol·L -1）
0 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 管 号 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 A 275nm 0 1.595 0 1.505 0 1.500 0 1.445 0 1.035 0 1.330
不同pH 值对木瓜蛋白酶活力的影响
缓冲液pH 5.0 6.0 7.0 8.0 9.3 管 号 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 A 275nm 0 0.034 0 0.011 0 0.113 0 0.043 0 0.023
则根据上述数据可绘制图如下：
激活剂（EDTA）对木瓜蛋白酶活力的影响
0.5
1
1.5
2
2.5
00.20.61
24
EDTA浓度吸光值
抑制剂（过氧化氢）对木瓜蛋白酶活力的影响0
0.5
1
1.5
2
00.250.51
24
过氧化氢浓度吸光值
不同pH 值对木瓜蛋白酶活力的影响
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
567
89.3
缓冲液pH 吸光值。