项目编号东北农业大学大学生科技创新基金申请书项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540的突变体鉴定项目主持人：李松所在学院：生命科学学院研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日东北农业大学教务处制项目名称拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540的突变体鉴定研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元项目主持人姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术指导教师（1）姓名才华职称讲师所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程指导教师（2）姓名纪巍职称助教所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处1．研究的目的意义基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。
与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。
bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。
本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。
本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。
2．国内外研究概况1)突变体鉴定的方法的研究现状反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。
目前，鉴定方法主要有2种(/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。
“三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。
野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到两种产物(如图1所示)。
图1. “三引物法”鉴定突变体的原理(/tdnaprimers.html) a: T-DNA 插入目的基因编码序列的方式、位置以及PCR 鉴定反应所需引物。
LP、RP：与目的基因片段互补的特异引物；插入T-DNA 片段的特异引物；N：T-DNA 的实际插入位点与侧翼序列之间的距离(通常为0~300 bp)。
b：3 种可能的基因型植株PCR 产物的差异。
WT ：野生型植株；HZ ：杂合突变体植株；HM ：纯合突变体植株。
2)AtbZIP1转录因子的研究进展在对植物逆境信号传导的研究中发现，转录因子是一个很关键的因素，在胁迫刺激下它们不断合成，并将信号传递和放大，调控下游基因的表达，从而引起植物生理生化的改变。
bZIP类转录因子是植物中比较重要的转录因子家族，参与众多的生理生化反应。
而最近发现，其在植物抗非生物胁迫反应中也起到一定的作用。
植物体内存在大量的转录因子，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中就有5.6%的基因是编码转录因子的。
典型的转录因子含有DNA结合区(DNA-binding domain)、转录激活区(activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site)以及核定位信号区(nuclear localization signal)等4个主要的功能区域，这些功能区域决定转录因子的功能和特性。
根据转录因子表达的特点可以将其分为两类，一类是组成型转录因子，无论在逆境还是正常状况下基因都表达。
另一类是诱导型转录因子，只有在逆境下基因才会表达，绝大部分的转录因子都是这种自身的反馈调节。
bZIP类转录因子是植物中一类很大的转录因子家族，其共同特点是：含有与特异DNA序列相结合的碱性结构域；参与寡聚化作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连；转录因子的N-末端含有酸性激活区；以二聚体形式结合DNA，肽链N-末端的碱性区与DNA直接结合。
bZIP类转录因子中有两类成员和植物非生物胁迫应答密切相关，一类是TGA/OBF 蛋白，D-亚家族的成员。
它们可以结合到as-1/ocs 类顺式元件上，在植物非生物胁迫应答及发育中起重要作用。
另一类转录因子是ABF/ABRE蛋白，A-亚家族的大多数成员属于此类蛋白。
该类转录因子可以识别ABRE类顺式作用元件（CACGTG），在盐胁迫和干旱胁迫中起重要作用[7]。
利用酵母单杂交的方法从拟南芥中分离出逆境诱导的4种bZIP蛋白，属于ABRE 结合因子（ABRE binding factors，ABFs）/ABRE结合蛋白（ABA-responsive element binding, AREB），分别是ABF1、ABF2/AREB1、ABF3和ABF4/AREB2。
在干旱、盐胁迫和ABA处理条件下这4种转录因子大量表达，诱导ABA的过敏感以及其他表现型，使植物体内的糖积累，内源ABA 合成，耐盐和耐旱等诸多抗性相关基因的表达增强。
参考文献[1]陈丽. (1999) 植物转录因子的结构与功能. 植物生理学通讯, 33:401~409.[2]Yamaguchi S K, Shinozaki K. (1994) A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsivenessto drought, low-temperature or high-salt stress. Plant Cell, 6:251~264.[3]Liu Qiang, Zhang Gui-You, Chen Shou-Yi. (2001) Structure and regulatory function of plant transcription factors.Chinese Science Bulletin, 46(4):271～278.[4]Liu L, White MJ, MacRae TH. (1999) Transcription factors and their genes in higher plantsfunctional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem, 262:247~257.3.创新点1）利用“三引物法”对拟南芥突变体进行插入T-DNA纯合鉴定；2）通过RT-PCR在转录水平上进一步鉴定突变体。
二、项目主要研究内容、目标与技术经济指标1．项目主要研究内容本研究利用植物生物工程研究室已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。
2．目标与主要技术经济指标（1）建立一套通用的植物突变体鉴定的方法；（2）获得AtbZIP1基因的拟南芥插入纯合突变体10株；（3）发表学术论文1篇。
三、项目研究方法与技术路线1． 项目研究方法（1） 种植拟南芥突变体；（2） 提取拟南芥的DNA ，利用“三引物法”鉴定插入纯合；（3） 提取拟南芥的RNA ，消除基因组DNA ；（4） 对提取得拟南芥RNA 进行反转录；（5） 用RT-PCR 鉴定AtbZIP1基因是否表达。
2． 技术路线四、项目前期研究基础、实验条件1．项目前期研究基础 本研究所依托的植物生物工程研究室长期从事植物基因工程的研究，近五年完成和在研科研项目19项，其中“973”前期、“948”项目和国家转基因专项和国家自然科学基金等。
研究室具有丰富的研究经验和基因资源。
本研究已购买了拟南芥突变体，为实验的进行提供了研究材料。
本组成员由于对科学研究的共同爱好自由组合。
目前已完成大学一年的学习任务；掌握了有关的基础知识；在课下学习了基因工程的有关理论知识；阅读了有关基因工程和植物生理相关拟南芥突变体种植确认拟南芥突变体“三引物法”鉴定纯合体 拟南芥DNA 提取 拟南芥RNA 提取“三引物法”鉴定插入 RNA 反转录RT-PCR 鉴定的书籍；查阅了关于突变体鉴定的相关文献，及PCR和RT-PCR的相关实验技术资料。
在实验能力方面，通过大一一年的实验课的训练，已掌握了基本的实验技能；课下学习了植物基因组DNA, RNA 提取以及PCR检测的实验及方法，能够独立进行研究中的有关操作。
2．实验条件本研究所依托的植物生物工程研究室建立了植物基因组DNA, RNA 提取以及PCR 检测平台，并拥有大量分子生物学研究的仪器设备。
五、经费预算（实验材料费、资料费等）1．实验材料费植物材料处理费200元PCR 引物合成费200元2．仪器使用费使用食品中心开放实验室仪器，仪器使用费600元申请经费总额1000元。
六、年度研究计划及预期进展2008年11月~2009年1月（1）拟南芥突变体的种植（2）拟南芥基因组DNA的提取2009年2月（1）“三引物法”鉴定插入纯合的PCR反应体系及条件探讨（2）利用“三引物法”鉴定纯合体（3）对纯合体进行T-DNA插入鉴定2009年3月~2009年5月（1）拟南芥总RNA的提取（2）拟南芥总RNA的反转录2009年6月~2009年7月（1）拟南芥内参基因RT-PCR（2）A tbZIP1基因At5g49540的反转录PCR鉴定（3）分析整理数据。