α-葡萄糖醛酸酶的研究进展摘要：α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖类半纤维素完全降解过程中必不可少的重要酶，它在构建彻底降解半纤维素的基因工程菌和半纤维素酶制品的应用开发方面的生物技术潜力正在越来越受到人们的关注。

本文从木聚糖的结构着重介绍α-葡萄糖醛酸酶的作用机理、酶活分析、酶纯化和基因克隆的研究进展。

关键词：木聚糖；α-葡萄糖醛酸酶；作用机制；基因重组技术木聚糖类半纤维素是仅次于纤维素的第二个重要的异源多糖，它以其数量大，组分易提取成为最具潜力的可再生资源[1]。

因此，各国政府都不断投入对木聚糖类半纤维素酶的研究。

尤其是石油危机引起的价格战更促使了人们对半纤维素发酵生产燃料乙醇的研究。

我国科学工作者在半纤维素酶方面已经进行了深入研究，并在食品加工、饲料、纸浆溶解及纸浆漂白上取得了可喜成绩。

但主要是集中在内切木聚糖酶的研究上[1]。

我国是一个农业大国，每年有大量的秸杆成为环保负担，而秸杆中约94%的半纤维素是阿拉伯糖葡萄糖醛酸木聚糖[1]。

如果将其生物降解为木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品，如有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类、溶剂或燃料。

但是，彻底降解木聚糖需要由多种水解酶组成的酶系统的协同作用。

这个木聚糖降解酶系是由内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶组成的。

α-葡萄糖醛酸酶在开发木聚糖类半纤维素中起着非常重要的作用，它的生物技术潜力正越来越受到人们的关注。

目前，有关α-葡萄糖醛酸酶的研究在国内还未见报道，本文将从木聚糖类半纤维素的结构、酶作用机制介绍有关α-葡萄糖醛酸酶及其基因的研究进展。

1 木聚糖的结构木聚糖是存在于植物细胞壁中最丰富的半纤维素，它是一个以β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链上带着一些不同的取代基像乙酰基、阿拉伯糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸和阿魏酸残基等而构成的[2]。

为了保证植物细胞壁的刚性，木聚糖则与细胞壁聚合物果胶质和木质素相连接，其中阿魏酸与果胶质和木质素中的酚酸残基形成共价键，并通过阿拉伯糖基连到木聚糖主链上。

细胞壁的木质素与4-O-甲基葡萄糖醛酸之间则通过4-O-甲基葡萄糖醛酸以酯键连接到木聚糖主链上[3]。

大多数硬木半纤维素是O-乙酰基-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖，它是一条约70个β-木糖吡喃型残基通过β-1.4-糖苷键相连的木聚糖主链（平均聚合度在150~200之间），平均每10个木糖残基就由α-1,2键连上一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基。

硬木木聚糖被高度乙酰化，每十个木糖单位的C-3和C-2位置上带有7 个O-乙酰。

用碱抽提木聚糖时，这些乙酰基很容易去除[4]。

软木和禾本科植物半纤维素中的木聚糖主要是阿拉伯糖-4-O-甲基葡萄糖醛酸木聚糖（平均聚合度在70~80之间），平均每6个木糖单位带有一个4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基，每8~9个木糖残基带一个α-L-阿拉伯呋喃糖单元，与硬木半纤维素相比，是未乙酰化的[2,4]。

秸杆半纤维素就属于此类。

2 α-葡萄糖醛酸酶在木聚糖水解中的作用机理由于异源木聚糖是高度分支的多糖，其主链和侧链含有不同的侧枝，主要有乙酰基、阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基等；当内切木聚糖酶随机作用木聚糖时便受到这些基团的空间阻碍，而不能到达所作用的木糖苷键，所形成的产物只能是带侧枝的低聚糖。

因此，木聚糖的完全降解需要多种水解酶的协同作用。

它包括主链水解酶β-1.4内切木聚糖酶、β-木糖苷酶和侧链水解酶α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶（如图1）[4]。

这些酶的协同作用，将木Endoxylanase:内切木聚糖酶；β-Xylosidase:β-木糖苷酶；α-Glucuronidase:α-葡萄糖醛酸酶；α-Arabinofuranosidase:α-阿拉伯呋喃糖苷酶；Acethy Xylan Esterase:乙酰木聚糖酯酶。

图3 木聚糖降解酶系的木聚糖降解作用Fig 1. xylan degradation of xylanolytic system聚糖转化为它的组成分糖。

α-葡萄糖醛酸酶（EC3.2.1-）水解甲基葡萄糖醛酸（４-O-MeGlcA）与葡萄糖醛酸木聚糖主干上木糖残基间的α-1.2键，该键对酸水解很稳定。

木聚糖中的葡萄糖醛酸通常被甲基化为４-O-MeGlcA。

自然界中的硬木、软木和禾本科植物木聚糖中都存在着这种α-1.2糖苷键连接的４-O-MeGlcA取代基。

当主链水解酶与木聚糖底物结合时，４-O-MeGlcA侧枝阻碍酶到达所作用的糖苷键，从而降低木聚糖的水解效率。

Shao W 等报道，如果α-葡萄糖醛酸酶与内切木聚糖酶同时存在时，它们相互促进，加速低聚糖的产生，同时低聚糖也需要经α-葡萄糖醛酸酶去除4-O-甲基葡萄糖醛酸侧枝后才能被β-木糖苷酶彻底降解作用[5]。

因此，α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖降解酶系中非常重要的一员。

α-葡萄糖醛酸酶的底物专一性依据酶源而不同，该酶的水解作用需要低分子质量的葡萄糖醛酸木聚糖为底物，它们能够从木聚糖内切酶水解产生的低聚木糖释放4-O-甲基葡萄糖醛酸。

α-葡萄糖醛酸酶只对聚合度DP大于2的取代低聚木糖有效[4]。

3α-葡萄糖醛酸酶活性分析方法用于α-葡萄糖醛酸酶活性分析的底物主要有4-D-甲基葡糖醛酸基木二糖、木三糖（４-O-MeGlcAX2、４-O-MeGlcAX3）、4-D-甲基葡糖醛酸基木糖醇（４-O-MeGlcA-xylitol）、糖醛二酸糖醛三酸混合物和４-O-MeGlcA取代的低聚糖混合物[6]。

人工合成p-硝基苯-α-葡萄糖醛酸被用于检测酶活性，但是，由于有些微生物的α-葡萄糖醛酸酶只对天然底物显示活性，而对人工生色底物不能分解，因此，到目前为止，该酶活性的测定还不能用人工生色底物替代。

α-葡萄糖醛酸酶活性测定是利用带有糖醛酸的低聚木糖（4-O-MeGlcAX2~4）与α-葡萄糖醛酸酶反应，结果产生的4-O-MeGlcA使得还原糖增加而显示出其活性。

最早采用的方法有气液色谱、薄层层析和硼酸盐复合物离子交换色谱对酶降解产物的分离。

其中，离子交换色谱是在NaOH-培养基检测α-葡萄糖醛酸酶活性的有效工具。

但是，该法操作比较繁琐。

现在α-葡萄糖醛酸酶活性测定是利用酶降解下产生的4-O-MeGlcA与砷钼酸钠的进行显色反应，最后在600~660 nm下用分光光度计测其吸收峰值[3]。

此法虽然较早期的测定方法有了很大改进，此，目前所报道的α-葡萄糖醛酸酶的研究，其酶活测定所用底物各不相同，结果不同生物之间的该酶活性很难进行比较[6,7]。

目前，人们正在利用一种新型合成底物或通过检测转化产物的结构研究α-葡萄糖醛酸酶的底物专一性[8]。

4α-葡萄糖醛酸酶的纯化和基因克隆由于α-葡萄糖醛酸酶在自然界出现不多，而且活性不高，因此直到1986年该酶才有报道。

迄今为止，α-葡萄糖醛酸酶是木聚糖侧枝分解酶中报道最少的。

目前，只有少数几个酶被纯化和定性，经过基因克隆和分析的就更少了（见表1）。

纯化的α-葡萄糖醛酸酶是分子质量为100 kDa左右的大分子蛋白质，采用的纯化技术主要为阴离子交换柱层析，疏水作用层析和凝胶过滤。

第一个α-葡萄糖醛酸酶是从嗜热真菌Thermoascus aurantiaus中利用DEAE-Sephadex离子交换柱层析和凝胶过滤纯化的[9]，该酶能以相同的速度从聚合木聚糖和低聚糖释放4-O-MeGlcA。

目前所研究的α-葡萄糖醛酸酶大多数只能作用4-O-MeGlcA取代的低聚糖或小型底物。

因此，大部分α-葡萄糖醛酸酶需要同水解主链的木聚糖酶一起协同作用以便从木聚糖释放出相当量的4-O-MeGlcA。

但是Thermoanaerobacterium sp ，Aspergillus tubingenis和Phanerochaete chrysosporium中的α-葡萄糖醛酸酶对聚合木聚糖也有少量活性，来自T.aurantiaus中的是这些纯化酶中对聚合木聚糖作用活性最高的[16]。

第一个从细菌中纯化的α-葡萄糖醛酸酶是来自嗜热厌氧细菌Thermoanaerobacterium sp.JW/SY485，它是通过阴离子交换柱层析和疏水作用层析纯化得到的。

该酶存在于细胞内，对于低聚木糖上的葡萄糖醛酸侧枝有较高的活性[5]。

有关α-葡萄糖醛酸酶的基因是木聚糖降解酶系中报道最少的，目前，在真菌和细菌中只有四个α-葡萄糖醛酸酶及其基因进行了分子水平的研究。

T. Reesei 中编码α-葡萄糖醛酸酶的基因glr1是第一个被克隆和定性的[18]。

它是EmlilioMargolles-clarky从以λ-ZAP为载体构建的T. Reesei Rut-30的cDNA表达文库中，通过α-葡萄糖醛酸酶的多克隆抗体筛选到的。

核酸序列分析表明，含有一个2541 bp的可读框架（ORF），编码一个847个氨基酸的蛋白质。

一个假定信号肽序列的切割位点被确定在距离起始密码子的19个氨基酸处。

成熟蛋白有828个氨基酸，与Siika-aho等人报道的纯酶分子质量91 kDa相同。

氨基酸序列上有8个糖基化位点。

Ruile P等从Thermotogo maritimn MSB8基因文库中，通过α-葡萄糖醛酸酶活性筛选法得到6.5kb的基因组DNA，并对其进行核酸序列分析、缺失实验及在大肠杆菌中表达，最后分离到一个编码674个氨基酸的α-葡萄糖醛酸酶基因，重组酶的凝胶过滤纯分子量大于630 kDa, 最适pH6.3,最大活性温度为85℃[3]。

接着，De Vries R P等从A. tubigensis 2菌中纯化到一个胞外α-葡萄糖醛酸酶[14]，经内切蛋白酶处理和反相HPLC分离后，得到7个末端和中间肽并对其进行N-端测序；根据测得的氨基酸序列设计合成九条简并引物，分别以A. tubigensis基因组DNA为模板进行PCR，获得一个1,142 bp的α-葡萄糖醛酸酶基因的部分片段，然后以该片段作探针从A. tubigensis的基因组文库中筛选到α-葡萄糖醛酸酶的完整基因。

该基因含有一个2523bp的阅读框，编码着841个氨基酸的蛋白质，并含有一个20个氨基酸的真核信号肽。

最近，Choi I D 等又从B. sterothermophilus中克隆到α-葡萄糖醛酸酶基因并测序[17]。

他们是根据B. sterothermophilus、T. Maritima和 A. tubingensis 3个菌中的α-葡萄糖醛酸酶基因的保守序列设计合成了两个简并引物，经PCR扩增到一个638 bp的PCR 产物用作探针，通过Southern杂交筛选到一个带有α-葡萄糖醛酸酶基因的克隆子。

该基因含有一个2073 bp的开放阅读框，编码691个氨基酸多肽[17]。