《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。

利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。

一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。

2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。

3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。

4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。

5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。

盛装动物的笼具等，也应付以标签。

6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。

7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。

动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。

任何用过的动物，不宜再做其他试验。

二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。

2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。

3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。

4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。

5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。

三、小白鼠腹腔接种[目的要求]l．掌握小白鼠腹腔接种的实验方法。

2．了解动物接种在微生物分离和鉴定中的作用。

3．了解其他的动物接种方法，如动物皮下、皮内、肌肉、家兔耳静脉注射等接种方法。

4．了解实验动物的处死和尸检的方法。

[原理]在临床微生物实验室中，动物接种主要用于分离和鉴定病原微生物。

通过在易感和不易感动物体内传代，微生物的各种性质都可能发生变化。

常用的实验动物包括大鼠、小鼠、豚鼠、家兔及绵羊等。

常见的接种部位包括皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔及脑内等部位。

本实验主要进行小鼠的腹腔内接种。

[器材和动物]1．菌液肺炎链球菌培养液。

2．器具鼠笼、无菌注射器、棉球煮针锅、剪刀、解剖台、大头针、纸张。

3．试剂碘酒、酒精、3％来苏儿、凡士林。

4．动物小白鼠。

[步骤和方法]１.接种方法：（１）用无菌注射器以无菌操作方式吸取肺炎链球菌培养液，吸取量稍多于使用量，排除气泡(将注射器针头朝上，使气泡上升，在针头上裹以消毒棉球，然后轻轻推出，须避免菌液四溅，特别注意防止眼结膜感染)。

（２）用右手轻拖小白鼠尾，使其爬行于粗糙物面上，再用左手拇指和示指抓紧小白鼠两耳及颈项皮肤，鼠体被固定在左手手指与掌间，用左手无名指和小指夹住鼠尾，用碘酒消毒腹壁皮肤。

（３）左手倾斜，使小鼠头部稍向下，将预先准备好的菌液注入腹腔内，注射时右手持已吸有菌液的注射器，针尖自小白鼠左侧腹股沟处刺穿皮肤，使针尖(针头宜小，常用5号针头)在皮下组织内向前移动1cm左右，然后再轻轻向下刺进腹腔。

抽吸注射器，如无回血或尿液，表示针头未刺人肝、膀胱等脏器，即可进行注射，注入菌液0.2ml后将针头退出，用酒精棉球轻擦针刺处消毒。

（４）将接种小鼠用的肺炎链球菌菌液作一张细菌涂片，以备与以后的实验结果比较。

（５）将注射后的小白鼠做好标记(以染液涂于鼠的头部或背部)，置于鼠笼中，填写实验动物记录卡或标签，包括实验动物的名称、编号、注射材料及部位、剂量和注射日期等，然后将卡片挂在动物容器上。

２.结果观察方法：（１）感染动物须隔离喂养，并逐日观察，注意有无发病症状，如食欲不振、竖毛、不活泼等现象，加以记录，必要时定期测量体重及体温。

若有致死可能，务必在动物濒死前及时杀死并作解剖，进行病原学和病理学检查。

（２）小白鼠在濒死前或死亡后立即进行解剖，若尚未死亡可用人工处死，如拉其头及尾部，使其颈椎脱臼，即刻死亡。

（３）将小白鼠胸腹部朝上，四肢用大头针固定于铺有纸张的解剖板上，用碘酒消毒整个胸腹部及四肢，左手用镊子提起耻骨部皮肤，右手持剪刀在其上剪开，然后由小口中将剪刀头部伸入，将皮肤分离，并沿正中线自耻骨到下腭处将皮肤剪开，四肢处皮肤亦用剪刀分离后剪开(注意不能将肌肉层剪破)，将皮肤向两侧剥离，露出整个胸腹部，观察皮下组织及淋巴结有无水肿、出血和肿大等病变。

(4)另换无菌镊剪，左手持镊子先将腹壁提起，依照剪开皮肤的方法，右手持剪将腹壁自耻骨到横膈，横膈向两侧，耻骨至两腿处剪开(注意勿剪破肠)。

然后将腹壁翻向两侧观察腹腔。

如有渗出液则用接种环取渗出液接种于适当的培养基，并作涂片和染色镜检。

同时亦可剪取脾或肝脏，取切面作压迹涂片，如欲做组织切片检查时，可将脏器剪下浸入10％甲醛液内固定。

(5)再换一套无菌镊剪，将两侧肋骨沿锁骨中线切开，用镊子夹住胸骨下缘，将横膈肋骨缘剪断，将剪断的胸骨向上翻起暴露出胸腔，观察心肺有无病变及胸腔有无渗出液。

用无菌镊子将心脏固定，剪开心包膜，烧灼心室表面，以无菌注射器插入心脏内取心血数滴，置血平板上进行划线分离培养(或把心脏剪成两半，将切面在平板面压印后，再行划线分离)。

将血平板放入37 ℃培养箱培养24h，亦可将心脏剪开做压迹涂片。

(6)将腹腔渗出液或脏器压迹涂片用革兰染色和荚膜染色法染色镜检。

(7)7)动物尸体解剖完毕后，用垫在尸体下面的纸张将尸体包裹，集中后放焚烧炉中焚化。

所用的剪刀、镊子、注射器等均应煮沸消毒，实验台用3％来苏儿消毒擦洗干净。

[结果]１．腹腔渗出液或脏器压迹涂片经革兰染色镜检，可见有荚膜的革兰阳性双球菌，形态和染色特征符合肺炎链球菌。

２．血平板分离培养的结果，在划线区出现细小、灰白色、α-溶血的纯菌落，经鉴定符合肺炎链球菌。

四、鸡胚接种[目的要求]掌握能用鸡胚分离培养的病毒种类及四种常用的鸡胚接种途径。

[器材和试剂] ．1．毒种流行性感冒病毒悬液、乙型脑炎病毒悬液及2型单纯疱疹病毒悬液。

2．来享鸡受精卵。

3．1ml注射器及6号、12号针头，无菌生理盐水。

4．其他卵架、检卵灯、碘酒、酒精棉球，无菌手术刀、镊子、剪刀，平皿、砂轮、透明胶带等。

[步骤和方法]1．鸡胚的准备：选择表面光泽干净，最好是白色蛋皮的受精卵，放入38～39℃孵卵器内孵育，相对湿度40％～70％。

孵育3天后，需每日翻动鸡胚1次。

第4天起，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵只见模糊的卵黄黑影，应予淘汰；受精卵可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，随着转动鸡胚可见胚影活动。

随后每天观察一次，若出现胚动吊滞或胚影固定于卵壳，或血管昏暗模糊者，说明鸡胚将要死亡或已死亡，需随时淘汰。

生长良好的鸡胚一直孵育到适当的胚龄。

2．接种方法：（1）尿囊腔接种法：1)取9～11日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室界限，于胚胎面与气室交界的边缘上约1mm处或在胚胎的对侧处，避开血管作一标记，作为注射点。

2)用碘酒、酒精消毒后，用无菌刀尖在记号处打一小孔。

3)用无菌注射器吸取流行性感冒病毒悬液，从小孔处刺入5mm，注入病毒液0.1-0.2ml(图4-1)图4-1 尿囊腔接种法4)用透明胶带封闭注射孔，蜡笔标记号码及日期等，放卵架上置33～35℃孵箱孵育，每日检视鸡胚的死活，如果鸡胚在接种后24h内死亡者为非特异性死亡，弃之。

5)孵育48～72h取出，放4℃冰箱过夜。

6)次日取出鸡胚，消毒气室部位卵壳，用无菌剪刀沿气室线上缘剪去卵壳，用无菌镊子撕去卵膜。

7)用无菌毛细吸管吸取尿囊液，收集于无菌试管内。

用血凝试验检测有无病毒。

（2）卵黄囊接种法：1)取6～8日龄鸡胚，于检卵灯下画出气室及胚胎位置，垂直放于蛋架上，气室端向上。

2)碘酒、酒精消毒卵顶部气室中央，用无菌刀尖锥一小孔。

3)用装有12号长针头的lml注射器吸取乙型脑炎病毒液，自小孔刺入，对准胚胎对侧，垂直接种于卵黄囊内，深度为35mm左右，注入病毒液0.2～0.5ml退出注射器(图4-2)。

4)透明胶带封口，置37℃孵育，每天检卵羊膜并翻动2次。

5)取孵育24h以上濒死的鸡胚，无菌技术于气室端开窗，用镊子提起卵黄囊蒂，挤出卵黄囊液，用无菌生理盐水洗去卵黄囊上的卵黄囊液后，将囊置于无菌平皿内，低温保存、备用。

（3）绒毛尿囊膜接种法：1）取12日龄鸡胚，于检卵灯下标记胚胎位置及大血管处。

2）碘酒，酒精消毒附近无大血管走行的卵壳处，用小锯片在其上锯一三角形窗，同时用无菌刀尖在气室顶部锥一小孔。

3）用针头挑去三角形窗之卵壳，勿伤及卵壳膜，滴加灭菌生理盐税1滴于壳膜上。

4）用橡皮吸帽从气室小孔吸气，可见盐水被吸下，绒毛尿囊膜下沉，去壳膜后可见壳膜与尿囊膜之间形成人工气室。

5）用注射器吸取0.2～0.5ml 2型单纯疱疹病毒液滴于绒毛尿囊膜上，用透明胶带口(图4-3)。

置孵箱37℃孵育4～5天后收获。

6) 剪开气室,若接种效果成功，可在绒毛尿囊膜上见到明显疹斑，用无菌剪刀剪下膜，置于无菌平皿内，低温保存、备用。

图4-2 卵黄囊接种法图4-3 绒毛尿囊膜接种法（4）羊水囊接种法：1) 取12日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室及胚胎位置。

2）碘酒、酒精消毒气室部卵壳，在气室顶开方形窗，选择无大血管处，用无菌镊子快速刺破绒毛尿囊膜进入尿囊后，再夹起羊膜，轻轻将其从绒毛尿囊膜破裂处拉出，以lml射器刺破羊膜，注入病毒液0.1～0.2ml（图4-4）。

3) 用镊子将羊膜轻轻送回原位，用透明胶带封闭气室端开窗，置孵箱37℃孵育3～5天。

4) 收获时，先消毒气室部，剪去壳膜及绒毛尿囊膜，吸弃尿囊液，夹起羊膜，用细头毛细吸管刺入羊膜腔内吸取羊水，收集于无菌小瓶内冷藏、备用。

图4-4 羊水囊接种法五、病毒细胞培养法（录像）细胞培养是目前最常用的病毒培养方法。

选择适当的原代培养细胞及传代细胞系作病毒分离培养。

细胞培养接种病毒的方法及病变观察（示教）：[材料]单层细胞培养瓶、营养液、Hanks液、无菌毛细滴管、病毒稀释液。

[方法]1．取已长成单层细胞的培养瓶二只，用无菌毛细滴管吸去管中液体，用Hanks溶液洗三次。

2．用无菌1ml吸管吸取稀释病毒液0.1ml加入一只单层细胞培养瓶中，另一只单层细胞培养瓶加0.1ml营养液作为对照，细胞瓶平放，使其接触整个细胞层，置37℃作用1小时，使病毒吸附到细胞上。