Circular YACs can be
separated easily from
linear yeast chromosomes
using standard alkaline lysis
methods, and exhibit far
BAC that contains a yeast centromeric sequence, a marker (KAN) for selection in yeast, and two sequences homologous to those flanking the EcoRI site in a standard YAC (pYAC4)
由于大多数酿酒酵母中都含有天然2μ质 粒，YEp复制所需的酶可由2μ质粒提供
11
YEp can replicate as an independent plasmid in yeast cell.
Recombination between plasmid and chromosomal
LEU2 genes can integrate YEp
A 15 Mb yeast host chromosome background cannot be separated from the YACs by simple methods
19
Circular YACs have a number of advantages over classical YACs
YRp也可整合到酵母染色体中去，与YIp整 合过程相同
15
4. YCp载体
着丝粒区域是染色体均匀 分配的重要顺式作用元件
将着丝粒片段插入到YRp 质粒中，能明显改善质粒 在母细胞和子细胞中的均 匀分配，提高质粒在宿主 细胞增殖过程中的稳定性
YCp以低拷贝存在
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YRp
YCpΒιβλιοθήκη 175. YAc毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统
能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中 生长
表达效率高
8
一、酿酒酵母菌的克隆载体
1. YIp (Yeast Integration plasmid )
该类载体是在大肠杆菌质粒载体中插入酵 母的标记基因构成
没有酵母菌的复制子顺序，只有依靠携带 的酵母基因与酵母染色体上的同源DNA整 合到染色体上去
A human library was constructed with
an average insert size of 810 kb and
with some inserts as large as 1800 kb.
18
Classical YACs have a number of deficiencies as vectors
转化体十分稳定，但也可能发生第二次同 源重组
9
r
Amp
YIp5 Tetr
ori
染 色 体DNA
URA3 Ura3
10
2. YEp
酿酒酵母中的2μ质粒
几乎所有酿酒酵母菌株中都存在一个约 6.3kb的野生型2μ环状质粒，它在细胞内的拷 贝数约70～200
YIp中可插入整个或部分2μ质粒DNA片 段构成YEp
大多数是以酵母菌氨基酸或核苷酸合成 途径中的酶基因作为选择标记，如ARG4， LEU2，TRP1，HIS3，URA3
使用这些遗传标记时，受体菌应是相应 标记基因的突变型，且是稳定的突变体 （缺失突变或多点突变），利用遗传互 补进行转化体的筛选
5
6
7
常用的酵母宿主系统
酿酒酵母表达系统
食品级安全性 表达效率较低
3
Ampr
Tcr
Ori
URA3
Ampr
Tcr
2μ
YIp
Ori
Ampr
Tcr
Ori YEp
2μ URA3
ARS
Ampr
Tcr
YRp
URA3
CEN
TRP1
Ampr
pYAC
Ori
Ampr
Tcr
YCp
Ori
URA3
TEL
HIS4
TEL
TEL
Ampr
URA3
Tcr
YLp TEL
TEL
4
酵母菌载体的遗传标记基因
into yeast chromosomal DNA.
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3. YRp
酿酒酵母基因组中每隔 30~40kb便有一个自主复 制序列（ARS）
The structure of ARS was shown to be a short (~100 bp) AT-rich sequence with the 17-bp core consensus WWWTTTAYRTTTWGTT (W=A or T, Y=T or C, and R=A or G)
含有ARS序列、遗传标记 基因及克隆位点的质粒组 成YRp
PstI
Amp ARS Ori
YRp12 6.9kb
Tc
BamHI
TRP1 URA3
EcoRI
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YIp
YRp
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YRp转化酵母的效率大幅度提高，但转化子 不稳定，经几代培养后，质粒丢失率高达 50%～70%，主要原因是YRp质粒不能在 母细胞和子细胞中均匀分配
第九章 酵母菌基因工程
1
酵母菌表达系统的优势
基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单 具有真核生物蛋白质翻译后加工修饰系统 酿酒酵母是安全型基因工程受体系统 大规模发酵工艺简单，成本低廉 可将外源基因表达产物分泌到培养基中 有助于阐明高等真核生物基因表达调控机理
2
酵母菌载体的类型
整合型（非自主复制型） 自主复制型
附加体型( yeast episomal plasmid, YEp): 复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒-2μ质粒 染色体复制型( Yeast Replicating plasmid， YRp)：复制起点来自染色体上的自主复制序列 ARS (Autonomous replicating sequence)
It is estimated that 10 – 60% of clones in existing libraries represent chimeric DNA sequences
Many clones are unstable and tend to delete internal regions from their inserts or lose some YACs during mitotic growth.