➢父系不表达称父系印记 ➢母系不表达称母系印记
差异甲基化区域
差异甲基化区域(differentially methylated region，DMR)，是指染色体上甲基化状态 具有亲本特异性的区域，即来源于不同亲
本的DNA序列甲基化状态不同的区域 差异甲基化主要发生在基因的启动子区，少数 在外显子，现已发现的印记基因大多数具有DMR 或受DMR调控。
➢ 研究发现失活的染色体上DNA序列都呈高度甲基化，
导致绝大多数基因转录处于关闭状态。 ➢ 避免因拥有两条X染色体而产生双倍
基因产物，保持和雄性动物X染色体 数量及功能上的一致性。
基因印记
基因组印记？
组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择 性，即只有一个亲本的等位基因表达，而 另一亲本的等位基因不表达或很少表达的 现象，相应的基因则称为印记基因。
C. 基因组范围的DNA甲基化模式与甲基化谱分析
1. 限制性标记基因组扫描 2. 甲基化间区位点扩增 3. 甲基化CpG岛扩增 4. 差异甲基化杂交 5. 由连接子介导PCR出的HpaII小片断富集分析
6. 甲基化DNA免疫沉淀法
高效液相色谱法
直接测序法
焦磷酸测序法
通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化 程度进行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。
31 引言及概念 2 甲基化的作用 3 甲基化检测相关技术 4 临床相关应用
甲基化检测相关技术
A．基因组甲基化水平(Methylation Content)的分析
1. 高效液相色谱 2. 高效毛细管电泳法
B．候选基因(Candidate Gene)甲基化分析
1. 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法 2. 重亚硫酸盐测序法 3. 甲基化特异性的PCR 4. 甲基化荧光法(MethyLight) 5. 焦磷酸测序 6. 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
➢ 优点：新型抗肿瘤药物 ➢ 缺点： 无基因特异性,不能选择性地活化沉默的目的基因，从而
会引起整体的低甲基化; — 是否会诱发第二肿瘤？ 药物的活化作用可逆，疗效依赖于药物的持续存在; 大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用
应用前景4--肿瘤的甲基化治疗
MGMT基因在许多肿瘤中被认为是抗肿瘤药物治疗的预测标记。MGMT启 动子肿瘤特异性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，从而使得肿瘤细胞对 烷化类的抗肿瘤药物敏感，因而被广泛用于肿瘤化疗治疗。
DNA甲基化与临床应用
目录
31 引言及概念 2 甲基化的作用 3 甲基化检测相关技术 4 临床相关应用
—— 基因决定命运
为什么熊猫是黑白的？
同卵双生的孪生子具有完全相同的基 因组。但他们长大成人后在性格、健康方 面往往存在很大差异。
先从表观遗传学谈起
基因
环境
表观遗传学
表型
相同的基因型
?
不同的表型
应用前景3--肿瘤的去甲基化治疗
➢ DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化 模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用， DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的 保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要 水平（去甲基化） —— 抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望
应用前景3--肿瘤的去甲基化治疗
DNA甲基化的概念
DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因 组CpG二核苷酸的胞嘧啶5‘碳位以共价键结合一个甲基基团。
DNA甲基转移酶： DNMT 胞嘧啶： Cytosine 5’-甲基胞嘧啶： 5-Methylctosine S-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸： SAH
应用前景2--肿瘤复发的独立预测因子
➢ 口腔鳞状细胞癌时存在RECK基因甲基化的患者 复发率明显增高
➢ 甲基化影响生存期 ➢ 膀胱癌中APC、GSTP1和TIG1基因发生异常甲基
化时，患者存活时间明显缩短
LONG N K, et al. Hypermethylation of the RECK gene predicts poor prognosis in oral squamous cell carcinomas[ J ]. Oral Oncol, 2008, 44 (11) : 1 052 - 1 058. ELL INGER J, et al. Hypermethylation of Cell - Free Serum DNA Indicates Worse Outcome in Patients With Bladder Cancer. J Urol, 2008, 179 (1) : 346 - 352.
肿瘤组织的DNA甲基化
➢ 肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的 甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。
➢ 肿瘤细胞的特征： 癌基因 低甲基化 → 被激活 抑癌基因 高甲基化 → 被沉默
应用前景1--肿瘤的早期诊断
➢ 抑癌基因发生异常甲基化是在肿瘤早期就发生 而且一直进行的，导致恶性肿瘤表型的表达
在发育和分化中调控基因的表达 ➢ 转录抑制 ➢ 特征性表型基因的表达（肤色、毛发） ➢ X染色体的失活（X-inactivation ） ➢ 基因印记 ➢ 碱基突变 ➢ 肿瘤代谢
DNA甲基化与胚胎发育
DNA甲基化作为一种可遗传的表观遗传 修饰，在体细胞增殖过程中通过依赖于DNA复 制的DNA甲基转移酶Dnmt1稳定地传递给子细 胞。但在胚胎发育的不同时期，基因组范围内 的DNA甲基化水平会发生剧烈的改变，改变最 剧烈的阶段为配子形成期与早期胚胎发育阶段， 甲基化模式在配子形成时已经建立。
DNA甲基转移酶(DNMT)
➢ 哺乳动物体内有三种DNA甲基化转移酶： ——DNMT1、 DNMT3A和DNMT3B。
DNMT1--- 持续性DNA甲基转移酶；与甲基化相关，缺 乏引起基因组低甲基化，染色体缺失、重排、突变畸形。
DNMT3A、DNMT3B--- 从头甲基转移酶；与去甲基化相 关，在胚胎干细胞和早期胚胎中高度表达，缺乏引起胚 胎死亡，在肿瘤组织中广泛高表达。
DNA甲基化在动物胚胎和生殖细胞发育过程中的重编程
转录抑制
CPG island的功能：通过甲基化与去甲基化，调控下游基因的表达 —— 基因表达的调控开关
影响基因表达
直接抑制基因表达或甲基化 的 CpG双核苷酸序列可被甲基结 合蛋白家族 识别，而后者可通过 吸引补充组蛋白去乙酞化酶和组 蛋白甲基化转移酶等组蛋白修饰 蛋白质来改变染色质的活性 ，以 间接方式影响基因表达。
Figure： Kaplan–Meier Estimates of Overall Survival, According to MGMT Promoter Methylation Status.
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全基因组甲基化图谱
全基因组甲基化测序（WGBS）
芯片平台
Illumina 850K芯片可检测人全 基因组约853,307个CpG位点的甲基 化状态。850K芯片不但保持了对 CpG岛，基因启动子区的全面覆盖， 还特别加强了增强子区以及基因编 码区的探针覆盖。广泛应用于干细 胞研究、肿瘤和其他复杂疾病研究， 是目前最适合表观基因组全关联分 析研究的全基因组DNA甲基化芯片。
碱基C
碱基突变
T突变
甲基化
突变
DNA甲基化与肿瘤
肿瘤细胞发生时常出现DNA甲基化模式的 变化，主要包括甲基化转移酶表达水平的提高、 基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲 基化水平的异常升高，从而导致基因组不稳定， 如染色质构象异常、转座子激活、原癌基因激 活表达以及抑癌基因被抑制表达等。
目录
Illumina 850K芯片技术流程
目录
31 引言及概念 2 甲基化的作用 3 甲基化检测相关技术 4 临床相关应用
正常生物DNA甲基化
➢DNA甲基化始发于胚胎早期，随着组织细胞 分化发育，基因组DNA经历了去甲基化、区 域性的重新甲基化以及组织特异基因选择性 的去甲基化的过程。最后，这种DNA甲基化 模式就相对稳定下来。
优点：DNA甲基化检测具有早期、无创、快捷、 灵敏度高等特点。（血液、粘膜上皮标本）
缺点：特异性不足
表观遗传学生物标记开发
2017年3月，张鹍教授团队在Nature Genetics（NG）杂志发布了令人振奋的研究成 果，利用更灵敏的算法配合组织甲基化模式开 发的无创诊断技术，可以检测并定位肿瘤。通 过比较肿瘤和正常细胞的DNA甲基化数据找到 肿瘤特异的甲基化Marker。
现代表观遗传学
➢ 概念： 基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表 达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。
➢ 表观遗传学的现象（基因表达的调控方式）：
– DNA甲基化---表观遗传学的核心（最初始的调控方式） – 组蛋白修饰 – MicroRNA – Genomic imprinting
不同层次表达调控
cfDNA甲基化液体活检技术
燃石医学自主研发了无创甲基化检测系统 (MERMAID™)，运用多层级甲基化探针设计策略， 可实现在检测成本可控的情况下同时检测超过10万个 临床诊断相关的甲基化CpG位点，并通过机器学习 算法建立分类模型，实现对检测样本自动分型。
cfDNA无创甲基化检测系统(MERMAID™) 用于 肺部占位病变（含肺癌）的早筛可实现99.6%的敏感 性和100%的特异性，用于肺部结节良恶性判定可实 84.8%的敏感性和87.5%的特异性。
特征性表型基因的表达
IAP: intracisternal A particle ▪ 去甲基化：灰鼠基因（agouti）仅微量表达 ▪ 甲基化：基因超量表达
X染色体的失活
➢ X染色体的失活（X-inactivation ）：生长发育过程中，
雌性哺乳类动物细胞中的两条X染色体其中一条失去活 性的现象。