1、目的
依据GB/T18204.10—2000游泳池水微生物检验方法大肠菌群测定，熟练掌握此规程，保证检验结果的准确性。

2、适用范围
本标准规定了游泳池水大肠菌群的测定方法。

3、责任
使操作者熟悉本规程，并在具体样品检验中严格遵照操作，确保检测结果准确性。

4、内容：
4.1定义：大肠菌群
指一群在36℃±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸、产气的需氧和兼性厌痒的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

第一法多管发酵法
4.2 仪器：
高压蒸汽灭菌器。

干热灭菌箱。

培养箱：36℃±1℃。

冰箱。

电炉。

天平。

灭菌平皿：直径9cm.
灭菌刻度吸管：1mL,10mL
灭菌棉拭子。

灭菌剪刀。

放大镜。

PH计或精密PH试纸。

4.3 培养基和试剂：
4.3.1乳糖胆盐发酵培养液
4.3.1.1成分：蛋白胨20g
牛肉膏3g
乳糖5g
氯化钠5g
1.6%（v/v）溴甲酚紫乙醇溶液1ml
蒸馏水1000ml
三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。

4.3.1.2制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH 值至7.2～7.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有带有倒管的试管中，在115℃高压灭菌15分钟。

4.3.2伊红美兰琼脂
4.3.2.1成分：蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂17g
2%伊红水溶液20ml
0.65%美蓝溶液10ml
蒸馏水1000ml
4.3.2.2制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH值至7.1，分装到烧瓶内。

121℃高压灭菌15分钟备用，临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美篮溶液，摇匀，倾注平板。

4.3.3革兰氏染色液
4.3.3.1结晶紫染色液：
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

4.3.3.2革兰氏碘液：
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

4.3.3.3脱色液：95%乙醇
4.3.3.4沙黄复染液：
沙黄0.25g
95%乙醇10ml
蒸馏水90ml
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

4.3.4染色法
4.3.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗。

4.3.4.2滴加革兰氏碘液，作用1分钟，水洗。

4.3.4.3滴加95%乙醇脱色，约30秒，水洗。

4.3.4.4滴加复染液，复染1分钟，水洗，待干，镜检。

4.3.5染色结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

4.4 推测性试验
4.4.1在两个装有50ml三倍浓缩乳糖胆碱培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。

4.4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆碱培养液的试管里各加入水样10ml。

4.4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36℃±1℃培养箱中，培养24h。

4.4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。

4.5 证实试验
4.5.1 平板分离
自推测性阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美兰琼脂平板上，置36℃±1℃培养箱
培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。

4.5.2 复发酵试验
挑取可疑大肠菌群菌落1或2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36℃±1℃培养箱中，培养24h。

4.5.3 凡乳糖发酵管最终产酸、产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。

记下证实试验的阳性管数，查总大肠菌群（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。

表1 总大肠菌群（MPN）检索表
第二法滤膜法
4.5仪器
滤器
滤膜：孔径0.45um。

直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和47mm两种。

抽滤设备
无菌镊子。

高压蒸汽灭菌器。

培养箱：36℃±1℃。

灭菌刻度吸管
冰箱
4.6 培养基
4.6.1品红亚硫酸钠培养基
4.6.1.1成分：蛋白胨10g
酵母浸膏5g
牛肉膏5g
乳糖10g
琼脂10～20g
磷酸氢二钾 3.5g
5%（碱性品红乙醇溶液20ml
蒸馏水1000ml
4.6.1.2储备培养基的制备
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900ml蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值至7.2～7.4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000ml，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。

4.6.1.3 平皿培养基的制备
将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品红乙醇溶液与培养基1:50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。

再按1:200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。

用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色褪成淡粉色为止。

将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰箱内备用。

此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。

4.6.2乳糖蛋白胨培养液
同4.3.1.
4.7 操作步骤
4.7.1 滤膜灭菌：将滤膜放入含有蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。

前两次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。

4.7.2 滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精灯棉球火焰灭菌。

4.7.3水样过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在滤床上。

固定好滤器，将100ml水样（如水样含菌量较多，可减少滤水样量或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在-0.5×105Pa（-0.5大气压）下抽滤。

4.7.4培养：水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。

用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。

然后将平皿倒置，放入36℃±1℃培养箱内培养18～24h。

4.7.5挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色、镜检。

紫红色，具有金属光泽的菌落；
深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡红色，中心色较深的菌落。

4.7.6将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中，于36℃±1℃培养48 h。

产酸产气者证实为大肠菌群阳性。

4.8 结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以10即为每1000ml水样中的大肠菌群数。