实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）
一、实验目的
了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。
二、实验原理
将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。
常用酶及底物
常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ>3.1
碱性磷酸酶（AP）
邻苯二胺（OPD）
四甲基联苯胺（TMB）
对硝基苯磷酸酯（p-NPP）
橙黄色
蓝色
黄色
棕黄色
黄色
黄色
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
常用的三种类型：
1、间接法测抗体（间接ELISA）
间接法用于测定抗体。
它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）
双抗体夹心法用于检测抗原。
它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。
操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。
底物的降解量＝抗原量。
3、竞争ELISA
竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。
它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。
三、主要仪器及试材
以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。
使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。
本试剂盒含:
1、包被抗原的微孔板；
2、阴、阳性对照血清；
3、抗猪IgG-HRP结合物；
4、洗涤液；
5、底物A液、B液；
6、终止液；
7、样品稀释液
本实验所需仪器和试剂：
1、酶联免疫测定仪
2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白）
3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清
4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP
5、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO
3，2.93g NaHCO
3
，加
ddH
2
O至1000mL
6、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4））： 8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g
Na
2HPO
4
·12H
2
O，0.2g KH
2
PO
4
，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH
2
O至1000mL。
7、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL
8、底物液（TMB-H2O2）：
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na
2HPO
4
，24.3mL 0.1mol/L 柠
檬酸液，加50mL ddH
2
O。
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。
底物液（TMB）：新鲜配制。
TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物
液加入0.2μL 30% H
2O
2。
9、终止液：0.25% 氢氟酸
四、实验方法与步骤
（一）试剂配制
1、包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）： 1.59g NaCO
3，2.93g NaHCO
3
，加
ddH
2
O至1000mL
2、洗涤液（0.05% Tween-20的PBS（pH7.4）：8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g
Na
2HPO
4
·12H
2
O，0.2g KH
2
PO
4
，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH
2
O至1000mL。
3、保温液（含0.1% BSA 的洗涤液）：0.1g 牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL。
4、底物液（TMB-H2O2）：
磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na
2
HPO
4
，24.3mL 0.1mol/L 柠
檬酸液，加50mL ddH
2
O。
TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。
底物液（TMB）：新鲜配制。
TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物
液加入0.2μL 30% H
2O
2。
5、终止液：0.25% 氢氟酸
（二）实验步骤
1、取已包被伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加100μl。
同样1∶40稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设2孔，每孔100μl。
另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl 稀释液（PBS）。
轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育20－30分钟。
2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，每次2－3分钟，200μl/孔，每次在干净吸水纸上拍干。
3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育20－30分钟。
4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。
5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。
室温避光显色，10分钟
后，每孔加终止液（0.25% 氢氟酸）1滴(50μl)，终止反应。
6、15分钟内测定结果。
采用波长630nm的酶标仪测定OD值。
检测样本的OD值≥0.4为阳性。
五、实验注意事项
1、实验前血清样品必须置37℃灭活30分钟。
2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。
洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。
洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。
3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。
六、实验结果处理
以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD
630值。
试验成立的条件是阳性对照孔平均OD
630
值
大于或等于1.0，阴性对照孔平均OD630值必须小于0.2。
样品OD
630
值大于0.4，判为阳性；样品OD630值在0.38到0.40之间，判为可疑；样品
OD
630
值小于0.38，判为阴性。
七、思考题
1、间接酶联免疫吸附试验的原理。
2、鉴别诊断基本原理及其意义。
3、间接酶联免疫吸附试验检测的临床意义。