（四）显色 1.显色是ELISA中最后一步温育反应， 此时酶催化无色底物生成有色产物， 反应的温度和时间仍是影响显色的 因素，定量反应中，温度和时间力 求准确。 2.显色反应结束时加入终止液终止反 应。
（五）比色
• 定性测定可采用目视比色或比色计（酶标仪） 测定结果。定量测定用比色计测定结果。 • 结果准确性取决于ELISA板底的平整与透明度 和比色计的质量。 • 比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。
第四节
其他酶免疫技术
一、均相酶免疫测定
• 基本原理：利用酶标抗原结合抗体形成 复合物后，标记酶的活性发生改变的原 理，在不将复合物与游离酶标抗原分离 的情况下，直接测定系统中总的标记酶 活性的改变，进而推算出待检样品中的 抗原量。 主要用于小分子抗原或半抗原的检测.
•分类
非竞争性结合法 均相酶免疫测定 抗体能抑制酶的活性
酶免疫技术概述
4、应用 广泛应用于免疫相关性疾病的诊断 微量蛋白质检测 酶和同工酶检测 肿瘤标志物检测 激素（肽类和非肽类）检测 药物和毒物检测
第一节
概
述
一、常用的酶及其底物： （一）酶选择的要求 ①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
3.原理
4、特点：
非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇 的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测
5.操作步骤
1） 包被抗体 。将特异性抗体与固相载体联结， 形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与 固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗 涤除去其他未结合物质。 3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物 上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的 酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本 中受检抗原的量相关。 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有 色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。
三、免疫印迹法
（immunoblottingtest，IBT）
亦被称为酶联免疫电转移印斑法 分三个阶段进行 : SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 电转移 酶免疫显色定位
基本原理
将不同分子量的抗原经SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳，分离到不同的区带，再转移到NC膜上， NC膜上的抗原分别与后加入的特异性抗体和酶 标抗抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗抗体复 合物，酶催化底物形成不溶性有色产物，使区 带染色。
②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。
③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色 仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含 量成反比。
竞争法检测HBcAb
标本（含抗体） 固相抗原
底物
E
E
E
E
E
酶标抗体
（2）竞争法检测HBeAb：
①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。
②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。
第二节 酶联免疫吸附试验 ——ELISA 一、基本原理 将抗体（抗原）包被在固相载体上，加 入待测抗原（抗体）和酶标抗体（抗 原），待反应后充分洗涤，使固相上形 成的抗原抗体复合物与其他物质分离， 最后加入底物，根据酶对底物催化的显 色反应程度，而对标本中的抗原（抗体） 进行定性或定量。
二、技术类型
3.原理
标本（含抗原）
E
底物
E
固相抗体
E
酶标抗体
4.操作步骤
E E E
E
E
E
（ +）
（ -）
5．注意事项 如果待检标本中抗原浓度过高， 容易 形成“钩状效应（hook effect）”。钩状
效应严重时，可出现假阴性结果，必要时
可将待检标本适当稀释后重新测定。
（三）竞争法 1.概念 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结 合，因此结合于固相的酶标抗原量与受 检抗原的量呈反比 2.应用 可用于测定抗原或抗体
（二）常用的酶和底物 1.辣根过氧化物酶（HRP）和底物 （1)来源: HRP在蔬菜作物辣根中含量很 高，纯化方法也不复杂。 （2）催化反应 : D2 H+H2 O2 — D+ 2H2O D2 H为色素原，D为色素。 （3）底物 : 四甲基联苯胺（TMB）、邻苯 二胺（OPD）等。
• TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比 鲜明，加酸终止反应后变黄色，可在比 色计中定量。(450nm) • OPD灵敏度高，比色方便，其缺点是配成 应用液后稳定性差，而且具有致异变性。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗 体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物显色液 A
终止液
反应板
显色液 B
浓缩洗涤液
加样枪与吸头
阴性对照
（一）双抗体夹心法 1.概念 用同一种抗体分别作为酶标抗体和固相 抗体以检测抗原的方法 2.应用：检测抗原最常用的方法
（四）间接法 1.概念 用固相抗原及酶标记抗抗体检测抗体的 方法 2.应用 间接法是检测抗体最常用的方法。只要 更换不同的固相抗原，可以用同一种酶 标抗抗体检测各种抗体。
3.原理
酶标二抗 标本（含抗体） 固相抗原 E
E
底物
E
4.操作步骤
E
E
E
E
E
E
E
E
E
（ +）
（ -）
（五） 双抗原夹心法检测抗体 1．原理 用同一种抗原分别作为酶标抗原和固相抗 原以检测抗体的方法 2．应用 用于抗体的检测
竞争性结合法
抗体能增强酶的活性
酶扩大免疫测定技术:
（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）
• 基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保 留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结 合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性 中心受影响而活性被抑制。
二、斑点—ELISA
双抗体夹心法测抗原
E
E
E
E
E
E
E
E
E
（ +）
（-）
6．注意事项
双抗体夹心法中，应注意类风湿因子
(RF)的干扰。如果待检标本中含有RF，
可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab’)2
或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。
（二）双位点一步法 1.概念 用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇 的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标 抗体，以检测抗原 2.应用 检测抗原，较双抗体夹心法更为简便省 时
③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。
④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比 色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗 体含量成反比。
竞争法检测HBeAb
标本（含抗体） 固相抗体 酶标抗体 E
E
抗原
E
底物
（七）捕获法
1.概念 先用固相化的抗人IgM抗体捕获IgM，再用 特异性抗原及其酶标抗体检测相应的IgM 2.应用 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异 性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。 因此测定IgM抗体多用捕获法
第七章 酶免疫技术
医学技术系检验教研室 段慧英
免疫标记技术
1.定义：
将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、 酶或荧光素等标记已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接 测定未知的抗原或抗体。 2.分类：
放射免疫技术 荧光免疫技术 酶标记技术 发光免疫技术
金标免疫技术
酶免疫技术概述 1、概念 以酶作为标记物标记试剂抗原或试剂 抗体，抗原抗体反应后，通过检测酶 促反应产物，以检测相应抗体或抗原 的分析方法。
3.原理
E
固相抗体
底物
标本（含抗体）
酶标抗原 E
E
4.操作步骤
E
E
E
E
E
E
E
E
E
（ +）
（ -）
（六）竞争法检测抗体 1．原理 同竞争法结合抗原。 HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但其
测定具体模式有区别。
2．技术要点
（1）竞争法检测HBcAb： ①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。
二、酶标抗体(抗原)的制备
1、制备要求： 抗原要求纯度高、抗原性强。 抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、 易于分离纯化和批量生产。
2、酶标记抗体（抗原)的方法 （1）改良过碘酸钠标记法 本法只适用于HRP的交联。 （2）戊二醛交联法 戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与 抗体或抗原的氨基通过它而偶联 三、酶标记物的纯化及鉴定
3、原理
4.操作步骤
E E
E
E
E
E
E
E
E
E
（ +）
（ -）
5、特点：
用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体 进行测定。 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab） 是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标 记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。 反应后，结合在固相载体上的酶标Ag（Ab） 的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的 浓度成反比。
微量反应板
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2.聚氯乙烯
与聚苯乙烯类似，特点为质软板薄，可切割， 价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对 蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也 略高。 3.微孔滤膜 如硝酸纤维素膜、尼龙膜等。 4.含铁的磁性微粒
四、测定方法 （一）加样加液体 ELISA中一般需进行1次加样和4-5次加液。 在定性测定中虽不特别强调加液量的准 确性，但也需要标准化。例如规定为加 液一滴，加液时加在孔底，避免加在孔 壁上部，并注意不可出现气泡。在定量 测定中则加样加液量应力求准确。