十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定1 材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。

溶液配制见附录A(标准的附录)2 操作步骤2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。

2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。

2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。

2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。

如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。

2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。

伪狂犬病聚合酶链式反应1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。

溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪2操作步骤：2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。

2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。

取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。

离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。

2.3. PCR的操作程序先将制备的模板DNA置100℃水浴10分钟作变性处理，，然后立即放于冰浴中。

PCR反应体系为：总体积25μl，含有50m •mol/L KCl,10m mol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.1％Triton X-100•，•100•μmol/L dNTPs，0.35μmol/L引物，2 m mol/L MgCl2，及0.5U Taq酶，1μl模板DNA。

常用的反应体系组成如下10×缓冲液 2.5 μl15mM MgCl2 2.5 μldNTPs 2.0 μl引物各2.0μlTaq聚合酶 1.0μlDNA模板 2.0μl灭菌去离子水 11.0μl矿物油约 20μl扩増条件为:94℃变性3分钟，进入循环，94℃60秒，65℃60秒，72℃60秒，40个循环后72℃延伸5分钟。

2.4 PCR产物的检测PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，在紫外光下观察结果。

为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR产物用SalI酶切，酶切产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较，可见产生的140bp和77bp两个片段。

伪狂犬病荧光抗体试验1材料准备：碳酸盐缓冲甘油、磷酸盐缓冲液、丙酮（分析纯），伪狂犬病荧光抗体、冰冻切片机，荧光显微镜。

溶液配制见附录D(标准的附录)2操作步骤2．1样品采集扑杀可疑动物，取大脑、淋巴结、扁桃体迅速送检实验室，如不能及时送出，必须冻结保存，避免腐败、自溶。

本法也可用于对疑似伪狂犬病病毒的培养物进行鉴定。

2．2切片制备将样品组织块切成1cm ×1cm的面，不经任何固定处理，直接贴于冰冻切片托上，进行切片，切片厚度要求5—7um，将切片展贴于0.8mm ×1mm厚的洁净载玻片上。

2．3固定：将切片置纯丙酮中固定15分钟，取出立即放入0.01mol/L，pH7.2的磷酸盐缓冲液中，轻轻漂洗3—4次，取出，自然干燥后尽快进行荧光抗体染色。

2．4 染色将伪狂犬病荧光抗体滴加于切片表面，置温盒内于37℃作用30分钟，取出后放入磷酸盐缓冲液中充分漂洗，再用0.5moL/L，pH9.0—9.5碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.1mm厚），染色后应尽快镜检，必要时可放置低温待检。

2．5观察将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。

2．6判定：于荧光显微镜视野中，见细胞中出现明亮的黄绿色荧光，判为伪狂犬病病毒感染阳性。

伪狂犬病微量中和试验（固定病毒，稀释血清法）1 材料准备0.25%胰酶（配制见附录B）、BHK-21细胞,多道可调微量移液器, ,96孔细胞培养板,CO2培养箱, 倒置显微镜。

2 操作步骤2.1 病毒半数组织细胞感染量（TCID50）的测定：2.1.1 病毒培养和收获将伪狂犬病毒接种于长成单层的BHK-21细胞，接种量为液体培养基量的10%,37℃培养，待出现病变后，冻融，收获病毒。

2.1.2 病毒的滴定用DMEM培养基将伪狂犬病病毒作连续10倍稀释，即10—1、10—2……每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板中，随后加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞100μL（细胞含量以105/mL左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设空白细胞培养对照。

置37℃5%CO2培养箱中。

2.1.3 TCID50计算逐日观察细胞病变，并记录细胞病变孔数，直到对照细胞老化脱落为止。

按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50（具体的计算示例见附录B）。

2.2中和试验将无菌采集的待检猪血清置56℃水浴灭活30分钟。

用DMEM 培养基作倍比稀释，在细胞培养板各孔中加入50μL培养基，随后在第一孔中加入经待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL再加入第三孔中，依此类推。

血清稀释度即为1：2、1：4、1：8……，每份待检血清稀释度作2—4个重复。

将50μL含200个TCID50的病毒液加入到不同稀释度血清孔中，37℃作用1小时，每孔中再加入100μL经胰酶消化分散的BHK-21细胞，同时设病毒对照、阳性血清、阴性血清，待检血清、正常细胞对照。

2.3计算抗体中和效价逐日观察，直至细胞对照出现老化脱落为止，按Reed-Muench两氏法，计算抗体中和效价。

如抗体效价为1：2及1：2以上，则判为伪狂犬病抗体阳性。

伪狂犬病酶联免疫吸附试验（间接法）1材料准备：抗原、酶标抗体，底物（OPD—H2O2），酶联免疫检测仪；溶液配制见附录F(标准的附录)2 操作步骤：2.1 包被将PRV抗原加入酶标板孔内，每孔100uL，37℃作用1h后置4℃冰箱过夜。

2.2 洗涤弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min，用吸水纸拍干2.3 封闭各孔加入封闭液100uL 37℃作用1h。

按2.2步骤洗涤2．4 加入待检血清待检血清经56o C30分钟灭活将待检血清用洗涤液稀释，每孔100uL，37℃作用1h。

重复2.2步骤。

2．5 加入酶标抗体用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100uL，37℃作用1h。

重复2.2步骤。

2．6 加入底物（OPD-H22）：每孔100uL，室温避光显色25分钟。

2．7 终止反应每孔加入50uL终止液终止反应。

2．8 测定OD值在酶联免疫检测仪上490nm波长处读数。

2．9血清阴阳性判定标准的确定取60份经中和试验检测为PRV抗体阴性的猪血清，按1:20稀释后进行间接ELISA试验，测定490nm波长处OD值，规定以60份血清的平均OD值加上3倍标准差作为判定阴阳性的临界值。

伪狂犬病乳胶凝集试验1材料准备：伪狂犬病乳胶凝集抗原、伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，溶液配制见附录E(标准的附录)2操作步骤：2．1待检血清不须经热灭活或其它方式的灭活处理2．2将待检血清用稀释液作倍比稀释后，各取15μL与等量乳胶凝集抗原在洁净干燥的玻片上用竹签搅拌充分混合，在3—5分钟内观察结果；可能出现以下几种凝集结果，即：100%凝集：混合液透亮，出现大的凝集块75%凝集：混合液几乎透明，出现大的凝集块50%凝集：约50%乳胶凝集，凝集颗粒较细25%凝集；混合液浑浊，有少量凝集颗粒0%凝集：混合液浑浊，无凝集颗粒出现如出现50%凝集程度以上的（含50%凝集程度），判为伪狂犬病抗体阳性，否则判为抗体阴性。

如为阴性，可用微量中和试验进一步检测。

伪狂犬病琼脂扩散试验1材料准备琼脂扩散抗原、阴性血清和阳性血清；优质琼脂粉、平皿2操作步骤2．1 0.8%琼脂板的制作将1克琼脂粉溶于100毫升Tris─盐酸缓冲液(Tris 6.5克, NaCl 2.9克, NaN3 0.2克, 蒸馏水 1000毫升, 用HCl调pH值至7.2)中，趁热倾倒于玻璃平皿上，厚度为2—3mm，待冷却凝集后，打孔，中央一孔，周围6孔，孔径为2mm，周围孔之间距离2mm，周围孔与中央孔间距为4mm—6mm，用酒精灯微热封底。

2．2加样将琼脂扩散抗原加到中央孔中，周围孔加经热灭活的待检血清，设阴性血清和阳性血清对照。

置温盒37℃作用，24—48小时后观察结果。

2．3结果判定在抗原孔与待检血清孔之间出现白色沉淀线，抗体可判为阳性；如待检血清抗体水平较低，可以观察到与待检血清相邻的阳性血清沉淀线末端略向抗原抗弯曲。

阴性血清与抗原孔之间则没有沉淀线。

伪狂犬病区分强弱毒感染鉴别乳胶凝集试验1．猪伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验伪狂犬病gG鉴别诊断乳胶凝集试验是用伪狂犬病毒gG基因的基因工程表达产物致敏乳胶抗原来检测动物血清、全血或乳汁中抗gG蛋白的抗体。

用于伪狂犬病毒感染猪与gG基因缺失疫苗注苗猪的免疫学鉴别诊断。

1．1材料准备：伪狂犬病毒gG蛋白致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒致敏乳胶抗原、伪狂犬病毒阳性血清和注射gG基因缺失疫苗血清、玻片、吸头等。