置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培
养液先培养菌盖，待菌盖形成之后再更换发酵
培养基。可更换1次也可数次，发酵液用来提取 柠檬酸。

置换法的优点是节省了大量培菌时间，发酵速度 快，而且原本不适宜长菌的原料都可用作发酵培 养基。

但为了保持菌盖的高活性，不能将发酵液残糖控
制得很低，这样一来就造成替换出来的发酵液残
柠檬酸发酵工艺
柠檬酸发酵工艺 工艺流程
柠檬酸发酵工艺 1、试管斜面菌种培养
察氏琼脂培养基：NaNO3 3g， 蔗糖 20g， K2HPO4 1g， KCl 0.5g， MgSO4.7 H2O 0.5g， FeSO4 0.01g， 琼脂20g， 用水定溶至1000ml， pH自 然。 察氏-多氏琼脂培养基：蔗糖30g， NaNO3 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， KH2PO4 1g， KCl 0. 5g， FeSO4.7H2O 0.01g， 溴甲分绿0.4g，琼脂 20g， 蒸馏水1000ml， pH自然。
1、试管斜面菌种培养
蔗糖合成琼脂培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g，
KH2PO4 2g， MgSO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g ， MnSO4.4H2O 0.02g， 麦芽汁20ml， 琼脂20g， 用 水定溶至1000ml。 米曲汁琼脂培养基：一份米曲加四倍质量的水， 于55℃保温糖化3~4小时后煮沸，滤液用水调整浓度 至10‘Bx，并用碱液将pH调制到6.0，接着添加琼脂 2%。确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉 孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。
糖量较高，给后道提取柠檬酸带来困难。
c 一般发酵法影响表面发酵的因素
a) 培养液层厚度 b) 糖浓度 c) 温度 d) pH值 e) 通风
③ 固体发酵

分为浅盘发酵和厚层通风发酵，统称曲法发酵。
固体发酵工艺具有的优点： （1）设备简单，投资少； （2）操作简单，能耗低，适应性强； （3）原料粗放，来源广泛，培养基简单； （4）发酵时间短 缺点是设备占地面积大、劳动强度大，传质传热 困难，产品回收率低，副产物多等。
2、 种子扩大培养 ① 二级扩大培养
a 培养基
有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前
者的培养基组成与斜面培养基相同，后者的组成
如下：麦芽汁7˚BX，氯化铵2%，尿素0.1%
2、 种子扩大培养 ① 二级扩大培养
b 培养

固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基， 250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。灭菌后摆成斜面， 凝固后的斜面至37℃下培养24h。确认无杂菌污染 即可使用。 液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中，使液层 深度达45cm，于0.1MPa下湿热灭菌15min。按无菌 操作接种。培养温度32℃。液体表面需7~10d，琼 脂固体培养需6~7d。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（5） 孢子接种数与菌球体的特征 柠檬酸发酵液中的菌球体是有一个或数个孢子在 生长过程物理作用形成的。菌球体的大小和数量 关系到发酵的成败，一般来讲，菌球体越小、越 多，产酸就越高，发酵周期也越短。菌球体的大 小和数量与孢子接种量有关。
② 表面发酵

采用表面发酵工艺具有一些优点： （1）设备简单，投资少，投产快； （2）操作技术简单，能耗低； （3）原料粗放，而且适于高浓度发酵，产酸浓度 也较高； 但表面发酵存在的问题是设备占地面积大，劳动 强度大，发酵时间长，菌体生长量多，而影响产 率等。

为了克服上、下曲盘的温差，在发酵40h左右时应
将曲盘上下对调。整个发酵期间
发酵终点根据酸度来判定，从48h开始测量酸度，
以后每隔12h测定1次，自72h以后则每隔4h测定1次， 在酸度达到最高时即出料，否则时间延长，柠檬酸 反而被菌体消化。
b 厚层通风发酵

② 三级扩大培养
可采用麸曲固体培养、液体表面培养或琼脂 固体培养。 所用培养基如下：
a 麸曲培养基： 新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与 第二级扩大培养基所用液体培养基相同。 b琼脂固体培养基： 与斜面培养基相同。
3、 发酵生产

柠檬酸发酵是典型的好氧发酵，工业上好氧发酵基
本上有三种，即表面发酵、固体发酵和液体深层发
酵。前两者是利用气相中的氧，后者是利用溶解氧。
这三种发酵方法都各有优缺点和经济可行性，工业 上仍然在使用。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的 空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶 解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对 于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养 法来讲，称为深层培养法。

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① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（3）控制生物量 正常的发酵液中生物量控制在12-20g/L，过多的生 物量影响氧的溶解，增加发酵罐的搅拌，且消耗大 量的葡萄糖，如果生物量的过度生长，柠檬酸的产 率则迅速下降。 （4）严防缺氧 柠檬酸是耗氧发酵，对氧十分敏感，当发酵进入产 酸期时只需要几分钟的缺氧时间，就会造成严重影 响，甚至完全失败。对于突然停电等在所难免的事 故，要采取紧急的补救措施，关闭进气阀，迅速启 动备用电源，防止发酵罐料液倒流到空气过滤器中， 用灭过菌的碳酸钙或石灰乳中和发酵液pH至2.5-3.5， 然后恢复正常操作。

接种后72h起进入产酸期，这时菌体代谢速率高， 耗糖快，发酵液酸度急剧升高，并释放出大量热， 此时应加强通风措施，严格将发酵温度控制在 26~28℃，以利柠檬酸的形成。 因此，一般在进入产酸期前8h左右需增大风量， 且降低进汽温度在25℃以下，湿度仍在75%以上。 160h以后发酵结束。

b 置换法
（3）添加法 有两种方法：一是分菌膜生长期和产酸期，生长 期的液层3cm左右，待菌膜形成，放掉菌膜下的生 长液，通入产酸培养基，液层在10~12cm，一直到 发酵结束。 另一种添加工艺是在液层为6~8cm的一段发酵基础 上，待产酸进入高峰期通入3~4cm的产酸培养基， 总液层达9~12cm，直至发酵结束。
② 表面发酵 a 一般发酵法

具体操作：接种后，培养温度维持在35℃72h左 右，这是黑曲霉的适宜生长温度，以促进孢子发 芽及菌体发育。当温度逐渐下降时，必须通入约 50℃的空气以维持35℃的培养温度。接种后20h 左右可出现灰白色、很薄的菌膜，72h时菌膜已 完全形成，菌膜相当厚且有皱褶。48h起由于菌 体耗氧增加，可开动另一组风管向盘层之间通汽， 进汽温度为40℃左右，进汽湿度为75%以上，以 防培养液水分蒸发过快。

③ 固体发酵 a 浅盘发酵
③ 固体发酵 a 浅盘发酵


浅盘固态发酵在发酵室内进行，发酵时也叫曲房， 需要配置无菌空调设备，室内放置盘架，以8~10层 为宜，架盘层垂直间距为15~20cm。 浅盘发酵的容器可以采用发酵盘（曲盘、竹盘等） 曲盘的厚度在6~8cm，材料可以是木质，铁质或不 锈钢等，盘底最好是多孔篩板，以利于通气。
③ 固体发酵 a 浅盘发酵

将曲置于曲室内培养，室温可按需要调节。在孢子 发芽和菌丝生长期，由于产生的热量少，品温会逐 渐下降，在入室后18h内，应维持品温在27~31℃。 培养18~48h期间，由于发酵热的大量释放，品温上 升很快，应采取措施，不得让品温超过43℃

菌体活力下降，所以品温会下降，此时应维持在 35℃左右，直至发酵结束。
特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求 以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培 养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。
① 柠檬酸的液体深层发酵工艺
（1）发酵温度 黑曲霉发酵柠檬酸温度控制在28~30℃，柠檬酸 产率最高，发酵速度较快，超过35℃时，虽然初 期产酸较快，但最终的发酵产率降低15%以上。 为了节约降温能耗，我国成功培育出高温发酵的 产酸微生物，可以在37℃发酵。 （2）pH 在薯干粉发酵柠檬酸中，初始pH不加调节, 约5.5。当接入菌种后，菌种生长繁殖，消耗氮 源和铵离子，使培养基的PH下降，前期pH下降较 快，活力强的菌种微生物培养12h后，ph可以降 至2.5-3.0，24小时后可以降至2.2-2.3，这时会 有少量的柠檬酸产生，但要到48小时后柠檬酸才 大量产生，才使pH下降至2.0以下。
b 厚层通风发酵

厚层发酵与空气的接触面小，所以需要在容器底部
设置空气通道，以利于通氧，这种发酵设备又称发
酵箱，这种发酵箱为厚层通风制曲箱，简称曲箱。 大型的曲箱可以配置翻曲机，这样曲层可以加厚。

机械通风固体曲发酵设备 1一输送带 2一高位料斗 3一送料小车 4一曲料室 5一进出料机 6一料斗 7一输 送带 8一鼓风机 9一空调室 10一循环风道 11-室闸门
b 厚层通风发酵

与浅盘发酵明显不同的是，在物料铺摊厚度上，厚
层发酵的曲醅厚度在50cm左右，比浅盘发酵的
15~20cm要大出许多。

为了给曲霉菌提供氧，在培养过程中需要进行机械 通风。

培养过程中的温度控制与浅盘发酵的温度管理相似， 但最高品温不能超过40℃。温度和湿度主要靠通风 来调节，因为物料厚度大，所以培养过程中需要翻 料。 厚层发酵比浅盘发酵优越之处在于：占地面积少， 污染杂菌可能性小，机械化程度高。
② 表面发酵
（1）一般发酵法 根据菌种的产酸能力，液层一般在8~12cm，一次 性发酵至结束。 （2）置换法 一次发酵结束，将酸液从菌膜下排走，然后在菌 膜下通入无菌水，静止1小时，待菌膜中酸液渗入 水中，排走洗水至贮酸桶，再通入置换液，液层 视菌种生产能力而定，一般在6~8cm。
② 表面发酵