皮肤细胞培养影响因素的探究陕西师范大学朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀（1.朱影陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；2.张瑞张晓张秀秀李晓陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；）指导老师：吴民耀副教授【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。
皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。
然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。
【关键词】：大鲵干细胞培养1.皮肤类干细胞的来源目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。
对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。
Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表皮。
Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。
另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。
20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有8~10个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。
Bickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。
Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。
关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。
Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。
因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。
2.皮肤类干细胞的生物学特性目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。
根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell T A细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。
干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。
正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。
于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation unit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一T A细胞一终末分化细胞。
在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。
表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。
慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。
在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0\G1期,其分裂增殖活动相对静止。
在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保持不变,而其他如T A细胞等随着细胞的不断分裂增殖其标记很快被稀释并逐渐消失。
表皮干细胞的另外一个特点是对基底膜具有茹附性。
在体内,表皮下细胞在整合素、连接素等表面茹附因子的介导下通过半桥粒茹附在基底膜上,离体只,大多数表皮干细胞在10min之内即勃附到胶原等细胞外基质上,而大多数T A细胞的勃附则发生在20一60min,所以可以根据干细胞的豁附性来进行鉴定。
表皮干细胞相对数量很少,Kolodka等研究表明,人和鼠的皮肤中,约有10%的基底层细胞为表皮干细胞。
但最近的研究表明将能快速粘附到Ⅳ型胶原上的10%的基底细胞仅仅有40%的细胞可以形成大克隆,表明基底细胞中仅有4%为表皮干细胞。
表皮干细胞属于全克隆细胞,在组织损伤或体外培养等条件下表现出持久的增殖能力和强大的克隆形成能力,一个干细胞形成的克隆细胞数可达5000以上,而T A细胞则为部分克隆细胞,多数T A细胞克隆数少于32个细胞。
表皮干细胞形成的克隆明显大于短暂扩增细胞的克隆。
在体内呈慢周期性,体外培养呈克隆性生长是分离鉴定皮肤类干细胞的最经典的方法,一直沿用至今。
3、不同消毒处理对细胞培养的影响皮肤直接与外界接触,一般在野外进行采样,易污染;加之一般是活体采样,对象多为育种价值高或珍贵稀有的动物,为了减少采样造成的应激、降低对其健康状况和应用价值的影响,所取的组织块都很小;所以为了提高培养的成功率,一般采用组织块法进行原代培养。
本试验以小鼠尾尖皮肤组织为研究对象作为预实验，比较不同消毒处理及培养方法的优缺点,选择合适的消毒处理及培养方法。
以免消毒处理不当，对珍贵的大鲵皮肤实验材料造成浪费。
3.1试剂OEME(高糖);新生牛血清(NCS);0.25%胰蛋白酶;0.1%胶原酶;1%新洁尔灭;1‰新洁尔灭;75%乙醇;70%乙醇;乙醚;双抗:青霉素8×104IU•ml -1链霉素1×105 IU•ml -13.2试验方法①采样前的消毒处理:用乙醚将小鼠进行麻醉后,用清水擦洗尾部并刮毛后,采用75%乙醇或l%新洁尔灭溶液擦洗多次,然后进行碘酒消毒、75%乙醇脱碘。
②采样用无菌剪刀剪断鼠尾,置无菌培养皿中,转移至无菌操作台上。
③采样后的消毒处理在无菌操作台上,进行消毒处理,主要方法有:A.70%乙醉浸泡30s;B.70%乙醇浸泡5min;C 1‰.新洁尔灭浸泡5min;D.双抗浸泡10min。
④接种培养消毒处理后,用PBS洗涤4~5次,将皮肤与软骨分离开,将皮肤组织剪成约1mm3的小块,自然沉降洗涤2次,然后进行组织块培养,观察消毒效果。
表1不同消毒效果的无菌效果比较Comparison of asepsis effect of different disinfectant methods组别Group消毒处理Disinfectant methods 消毒效果Effect of disinfection洗涤W ashing浸泡Marinate浸泡时间Time ofmarinate感染Infection无菌Disfection细胞生长情况Grouth ofcell1 75%乙醇75%乙醇30s5min 5111无细胞长出无细胞长出2 75%乙醇1%新洁尔灭5min3 无细胞长出3 75%乙醇双抗10min 2 有细胞长出但生长不良4 1%新洁尔灭1%新洁尔灭5min 4 生长良好5 1%新洁尔灭双抗10min 7 生长良好3.3不同消毒处理的效果从表可见联合使用乙醇与碘酒、双抗的消毒效果不理想,消毒不彻底或细胞生长不良;新洁尔灭与碘酒、双抗联合使用的消毒效果比较好,消毒彻底,且细胞生长良好,对时间要求不严格,操作简单方便。
要配制不同抗生素含量的PBS,在洗涤皮肤组织块时也需要不停更换PBS,操作比较繁琐。
本试验结果表明,采用高浓度双抗浸泡10而n或1%o新洁尔灭浸泡5min,均能达到较好的消毒效果,且对细胞的损伤较小,细胞生长良好。
该消毒方法能克服乙醇浸泡对时间要求的紧迫性,简化了操作步骤,又可省去配制和使用含不同抗生素浓度的PBS 的繁琐,值得推广和应用。
4四种不同培养基对细胞的影响用四种不同的基本培养液培养细胞,在培养的第6天消化收集细胞进行计数,,①培养液准备根据试验用四蒸水配制以下培养液I:TCM199+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;11:DMEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两霉素;111:DMEM/F12+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;IV:Fl2+100IU/青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素。
取第四代长成单层的细胞用消化液消化后,将细胞悬液分为相同的I、Ⅱ、Ⅲ、IV四个部分,分别离心10min,弃去上清液。
四部分分别用基本培养液I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ调整浓度为4x104cells·ml-1。
接种24孔培养板,每孔1mL,共接三孔,37℃，5％CO，饱和湿度下静置培养,24h后分别换与原接种培养液相同的培养液一次,以后每两天换液一次,于培养的第六天收集细胞进行计数。
表2基础培养液TCM199 DMEM DMEM/F12 F12计数器1 17.08 19.5 17.10 16.05计数器2 16.95 19.85 16.80 15.90计数器3 17.20 19.29 16.75 15.98接种细胞数(D0) 2.45 2.45 2.45 2.45群体倍增值（X） 2.857 2.997 2.785 2.7065.血清浓度对细胞生长的影响在添加5mM Hepes的DMEM基本培养液中,分别添加10％、15％、20％的胎鼠血清,分组培养纯化皮肤成纤维细胞。
培养的第六天,用台盼蓝染色,在血球计数板上进行细胞计数,以各组细胞的平均值评估其作用。
以低糖DMEM为基本培养液,在添加血清、Hepes的同时添加不同剂量的EGF、IGF一l,分组培养,在培养的第六天各取三瓶进行计数,以细胞生长倍增值为准,评估生物活性因子对皮肤成纤维细胞生长的影响。
以DMEM为基础培养液,分别添加不同浓度的血清,培养皮肤成纤维细胞,培养后第6天进行细胞计数,结果表明,添加10%,15%,20%FCS对细胞生长的影响是,随着血清浓度升高细胞生长呈渐增趋势,但无显著差别(P＞0.05)。