《生物化学工程》课程设计柠檬酸发酵生产及其生物反应器的设计目录一、引言 (3)1.1柠檬酸简介 (3)1.2柠檬酸生产的发展历史 (3)1.3柠檬酸的应用 (4)1.4柠檬酸的发酵方法 (5)二、柠檬酸的生产 (5)2.1原料 (5)2.2菌种 (5)2.3生产发酵机理 (6)2.4生化过程 (7)2.5工艺流程 (9)2.6工艺流程图 (10)三、生物反应器 (11)3.1生物反应器构造图 (11)3.2生物反应器的应用 (12)3.3发酵生产中的条件控制 (16)四、柠檬酸生产的后提取技术 (17)4.1提取技术 (17)五、深层液体柠檬酸发酵技术需改进方面 (19)六、参考文献 (19)一、引言1.1柠檬酸简介柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基-丙烷-1，2，3羧酸，英文名称： citric acid，分子量：192.14檬酸是一种含羟基的三元梭酸, 其化学式为, 学名为一羟基一羧基戊二酸, 为无色半透明晶体, 或白色颗粒, 或白色结晶粉末, 它的结晶形态因结晶条件不同而不同, 虽有强烈酸味但令人愉快, 稍有一点后涩味。
商品柠檬酸主要有无水柠檬酸C6H8O7和一水柠檬酸C6H8O7·H2O 。
柠檬酸易溶于水, 能溶于乙醉, 而不溶于醚、苯、甲苯、氯仿等有机溶剂。
1.2柠檬酸的发展简史1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。
他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。
天然柠檬酸最初产于美国加利福尼亚州、意大利和西印度群岛。
意大利的产量居首位。
1922年，世界柠檬酸的总销售额的90％由美国、英国、法国等垄断。
发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。
1893年C.韦默尔发现青霉（属）菌能积累柠檬酸。
1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。
1916年汤姆和柯里以曲霉属菌进行试验，证实大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。
如柯里以黑曲霉为供试菌株，在15％蔗糖培养液中发酵，对糖的吸收率达55％。
随着生物技术的进步，柠檬酸工业有了突飞猛进的发展,全世界柠檬酸产量已达0.4Mt。
在柠檬酸发酵技术领域，由于高产菌株的应用和新技术的不断开拓，柠檬酸发酵和提取收率都有明显提高，每生产1t柠檬酸分别消耗2.5～2.8t糖蜜,2.2～2.3t薯干粉或1.2～1.3t蔗糖。
人们正在大力开发固定化细胞循环生物反应器发酵技术1.3柠檬酸的应用柠檬酸由于具有无毒、安全、溶解性好、酸味可口、以及调节pH 值和对金属离子的鳌合作用等特点，传统用途以食用为主，作为酸味剂和抗氧化剂应用于食品与饮料工业。
70 年代以后，柠檬酸在其他工业领域也得到了广泛应用，特别是在洗涤剂中代替磷酸盐作为增效助剂，在生产无磷洗涤剂中担任了重要角色。
1.3.1 用于食品与饮料柠檬酸及其钠盐、钾盐，广泛地应用于各种饮料与食品中，作为酸味剂加入果酱、果冻、蜜饯、糖果、糕点和各种饮料中。
在海产品、罐头水果和蔬菜中加入柠檬酸，可降低其pH 值，从而抑制微生物的生长，延长保存时间。
1.3.2 用于医药和化妆品柠檬酸是生产多种药品的原料，如柠檬酸铁铵可作为补血剂，柠檬酸钠用作输血剂等。
另外，柠檬酸及其盐类可作为酸化剂，加入许多药品中，使pH 值控制在最佳条件，同时鳌合金属离子，以保持药品的性能稳定，防止有效成分氧化。
在各种化妆品中，如洗发剂、染发液、洗涤剂、牙膏中加入柠檬酸，可以作为缓冲剂调节pH 值，以防止产品分解和变质。
1.3.3 在工业中的应用柠檬酸钠可代替磷酸盐作为增效剂，应用于各种日用和工业洗涤剂生产中。
由于磷酸盐在水中富集会使藻类迅速生长繁殖，严重影响生态平衡。
因此，许多国家都已经禁用或限用含磷洗涤剂。
柠檬酸钠能够螯合硬水离子，使斑点分散，去污效果很好，而且柠檬酸可被生物降解，不会造成环境污染。
所以，柠檬酸钠可用于生产无磷洗涤剂。
1.3.4 在农业生产中的应用柠檬酸及其钱盐可以和液体肥料中的铁、铜、锌等微量营养元素整合，形成可溶性整合物，使肥效增加。
在动物饲料中加入柠檬酸及其盐类，可增强饲料的效力。
1.3.5 在塑料工业中的应用柠檬酸和碳酸氢盐可代替氯氟化碳，在聚苯乙烯泡沫塑料中用作发泡剂。
柠檬酸钠可用作无毒增塑剂，生产聚氯乙烯薄膜。
此外，柠檬酸及其盐类还广泛应用于锅炉清洗业、无氰电镀、石油工业以及水泥缓凝、织物、纸张、陶瓷等的加工过程中。
1.4柠檬酸的发酵方法发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵 3种方法固态发酵：以薯干粉、淀粉粕以及含淀粉的农副产品为原料，配好培养基后，在常压下蒸煮，冷却至接种温度，接入种曲，装入曲盘，在一定温度和湿度条件下发酵。
液态浅盘发酵：以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
深层发酵：产柠檬酸的主体设备是发酵罐。
微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。
二、柠檬酸的生产2.1原料柠檬酸发酵生产可使用的原料品种很多, 但共可划分为两类, 即糖质原料和石油原料。
糖质原料包括薯干、薯渣、淀粉、淀粉渣及玉米粉, 各种粗制糖粗蔗搪, 怡糖等、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜, 葡萄糖母液等。
石油原料主要包括一的正烷烃。
以石油为原料柠檬酸发酵的研究以日本、美国的研究报道占多数。
虽然用于柠檬酸生产的菌种可采用多种碳源, 但以蔗糖和葡萄糖为佳, 许多原料需进行纯化, 因为有些微量元素会影响柠檬酸的产生。
本设计主要以薯干为原料。
2.2菌种常用菌种为产黑曲霉（Aspergillus niger）。
本设计使用黑曲霉CO827。
2.3生产发酵机理2.3.1柠檬酸生物合成的代谢调节薯干内含有淀粉，经过粉碎打浆后，在黑曲霉分泌的淀粉酶的作用下，氧化分解+和呼吸活性提高，使通过糖酵解途径的为葡萄糖，此时黑曲霉的大量的胞内NH4代谢得到加强，葡萄糖经EMP通络分解成为丙酮酸，进入三羧酸循环，在丙酮酸脱氢酶复合物的作用下氧化成为乙酰CoA以及CO，然后在柠檬酸合成酶作用下与2草酰乙酸缩合而形成柠檬酸，而异柠檬酸脱氢酶、乌头酸酶因受抑制，而使柠檬酸得以积累如下图：柠檬酸合成途径糖酵解及丙酮酸代谢的调节：正常情况下，柠檬酸、ATP 对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP 、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP 对磷酸果糖激酶的抑制作用。
铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。
合成代谢中酶的作用：TCA 环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。
但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA 环的第一个特点。
顺乌头酸酶：顺乌头酸酶会将糖酵解途径所积累的柠檬酸进一步转化，从而使柠檬酸无法积累，因此顺乌头酸酶失活，阻断TCA 环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。
顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH 值降低。
2.4生化过程1.薯干内含丰富淀粉，经粉碎打浆后，淀粉由黑曲霉分泌的淀粉酶水解为葡萄糖：(C6H10O5)n(淀粉)+nH2O−−→−淀粉酶 nC6H12O6(葡萄糖) 2.葡萄糖经EMP 途径生成丙酮酸：EMP 反应式：葡萄糖 + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 磷酸→ 2 NADH + 2 丙酮酸 + 2 ATP + 2 H2O +2 H+3. EMP途径：4. TCA循环途径：TCA循环反应式：乙酰CoA+3NAD+FAD+GDP+Pi+2H2O−→−2O2+3NADH+3H++FADH2+GTP+CoASH其详细过程如下：(1)乙酰-CoA进入三羧酸循环乙酰CoA具有硫酯键，乙酰基有足够能量与草酰乙酸的羧基进行醛醇型缩合。
首先柠檬酸合酶的组氨酸残基作为碱基与乙酰CoA作用，使乙酰CoA的甲基上失去一个h+，生成的碳阴离子对草酰乙酸的羰基碳进行亲核攻击，生成柠檬酰CoA中间体，然后高能硫酯键水解放出游离的柠檬酸，使反应不可逆地向右进行。
该反应由柠檬酸合成酶催化，是很强的放能反应。
由草酰乙酸和乙酰CoA合成柠檬酸是三羧酸循环的重要调节点，柠檬酸合成酶是一个变构酶，ATP是柠檬酸合成酶的变构抑制剂，此外，α-酮戊二酸、NADH能变构抑制其活性，长链脂酰CoA也可抑制它的活性，AMP可对抗ATP的抑制而起激活作用。
(2)异柠檬酸形成柠檬酸的叔醇基不易氧化，转变成异柠檬酸而使叔醇变成仲醇，就易于氧化，此反应由顺乌头酸酶催化，为一可逆反应。
(3)第一次氧化脱羧在异柠檬酸脱氢酶作用下，异柠檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸的中间产物，后者在同一酶表面，快速脱羧生成α-酮戊二酸、NADH和co2，此反应为β-氧化脱羧，此酶需要Mg2+作为激活剂。
此反应是不可逆的，是三羧酸循环中的限速步骤，ADP是异柠檬酸脱氢酶的激活剂，而ATP，NADH是此酶的抑制剂。
(4)第二次氧化脱羧在α-酮戊二酸脱氢酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA、NADH·H+和CO2，反应过程完全类似于丙酮酸脱氢酶系催化的氧化脱羧，属于α氧化脱羧，氧化产生的能量中一部分储存于琥珀酰CoA的高能硫酯键中。
α-酮戊二酸脱氢酶系也由三个酶(α-酮戊二酸脱羧酶、硫辛酸琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)和五个辅酶(tpp、硫辛酸、hscoa、NAD+、FAD)组成。
此反应也是不可逆的。
α-酮戊二酸脱氢酶复合体受ATP、GTP、NADH和琥珀酰CoA 抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的调控。
(5)底物磷酸化生成ATP在琥珀酸硫激酶的作用下，琥珀酰CoA的硫酯键水解，释放的自由能用于合成GTP(三磷酸鸟苷）在细菌和高等生物可直接生成ATP，在哺乳动物中，先生成GTP，再生成ATP，此时，琥珀酰CoA生成琥珀酸和辅酶A。
(6)琥珀酸脱氢琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸氧化成为延胡索酸。
该酶结合在线粒体内膜上，而其他三羧酸循环的酶则都是存在线粒体基质中的，这酶含有铁硫中心和共价结合的FAD，来自琥珀酸的电子通过FAD和铁硫中心，然后进入电子传递链到O2，丙二酸是琥珀酸的类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，所以可以阻断三羧酸循环。
(7)延胡索酸的水化延胡索酸酶仅对延胡索酸的反式(反丁烯二酸) 双键起作用，而对顺丁烯二酸(马来酸)则无催化作用，因而是高度立体特异性的。
(8)生成苹果酸(9)草酰乙酸再生在苹果酸脱氢酶(malic dehydrogenase)作用下，苹果酸仲醇基脱氢氧化成羰基，生成草酰乙酸(oxalocetate)，NAD+是脱氢酶的辅酶，接受氢成为NADH ·H+5.代谢合成柠檬酸的总生化反应方程式：葡萄糖EMP −−−−−→途径丙酮酸−−−−−−−−→丙酮酸脱氢酶复合物CO 2 +乙酰CoA −−−−−−−−−−−−−−→草酰乙酸柠檬酸合成酶柠檬酸2.5.工艺流程1.原料的预处理：将薯干粉碎打浆后，用淀粉酶在80～105℃的条件下将淀粉水解，当料液与典反应不呈蓝色即为液化终点。