基因工程制药
质粒类型
微生物表达系统
严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝 的质粒，pSC101 松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝 数的质粒，pMB1和colE1。 克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因。 测序质粒：用于基因测序。 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。 表达质粒：能表达基因产物
能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖 迅速，倍增期约2小时。
酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序， 遗传背景已相当清楚。
基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基 因
基因工程制药
3、表达载体
微生物表达系统
含有复制起始序列或整合序列、选择标记以及由启动、 终止子和信号肽序列构成的表达盒序列。
菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
基因工程制药
2、生化与遗传特性
微生物表达系统
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限 培养基上生长，发酵糖，产气产酸。
基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株。 基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。
染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。
基因工程制药
微生物表征
细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。 繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。 菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
基因工程制药
2、生长与遗传特征
微生物表达系统
孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细 胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。
态 ⑤ 蛋白质自身不稳定。
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5、优 缺 点
微生物表达系统
发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。 具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％）， 培养周期短，抗污染能力强。 不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。 细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具
有抗原性，产生热源。 N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
第十四章 基因工程制药 工艺
第一节 基因工程制药微生物表达系统 第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术 第三节 基因工程菌的发酵培养与控制
基因工程制药
大肠杆菌的构建技术
基因工程技术-基因重组示意图
DNA片段酶切、 连接，形成重组 DNA分子
导入宿主细胞系 统中扩增
目标基因表达， 生成新产物，出 现新性状。
基因工程制药
3、质粒载体
首字母： 大写：细菌属名 2-3字母： 小写：细菌种名 如 EcoR 1 4 : 大写: 菌株 1，2…: 分离到酶的次序
复制子 选择标记 多克隆位点
微生物表达系统
基因工程制药
质粒载体的基本特征
微生物表达系统
自主复制性：
复制子：复制起始点及控制复制频率的调控元件。质粒不依赖于 染色体DNA而自主复制
四种类型： YIp酵母整合载体 YCp酵母着丝粒载体 YRp酵母复制载体 YEp酵母附加载体
基因工程制药
4、优缺点
微生物表达系统
优点： 五种类型的载体，——安全、无毒。 营养缺陷选择外来质粒。 培养条件简单、大规模培养技术成熟。 亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工， 并具有良好的蛋白质分泌能力。
选择性标记：质粒编码的选择标记，产生一种新的表型，用
于转化体的筛选。抗生素抗性基因，氨苄、四环素、卡那霉素等
多克隆位点：是外源基因插入载体的位置，有多种常见的限
制性内切酶位点序列构成
不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒
不能稳定地存在于同一宿主细胞内
转移性：从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞/菌。
基因工程制药
6、应 用
微生物表达系统
大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。 多肽类2种（甲状旁腺激素、利尿钠肽） 激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化) 细胞因子类：5种干扰素α、干扰素β和γ，2种G-CSF， 白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂 溶栓酶类：r-PA 白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。
第十四章 基因工程制药 工艺
第一节 基因工程制药微生物表达系统 第二节 基因工程大肠杆菌的构建技术 第三节 基因工程菌的发酵培养与控制
获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）
培养工程菌
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
成品检定
包装
基因工程制药
微生物表达系统
第一节 基因工程制药微生物表达系统
14.1.1 大肠杆菌表达系统 14.1. 2 酵母表达系统
缺点： 酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。 修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。
基因工程制药
5、应用
微生物表达系统
1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素 激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和 水蛭素 细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子 多肽类：高血糖素 2种乙肝疫苗等。 8种产品
基因工程一制种药蛋白质不溶性聚集体，包括
目白标一蛋级白结、构菌是体正4、蛋确产白的等，物。但表目立达标体形蛋结式
构是错误的，所以没有生物活性。
微生物表达系统
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体
可溶性蛋白质：存在于细胞质
周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有
利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。 大过①胞肠高蛋外杆 ，白分菌超过泌中过量表目正积达标常聚：产 代，胞物谢超内的水过可表平溶溶达，解性水过度蛋平多，白导质致分沉泌淀到；胞外的培 养表②液达蛋中产白。物生聚成集太在快细，胞分内子，间形疏成水不基团相互作用而聚集沉淀； 溶③性蛋的白包生涵成体太。快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀； ④表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状
基因工程制药
微生物表达系统
基因工程菌： 以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表
达外源基因，过量或抑制表达自身基因的工程生物体。
种类： 大肠杆菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。
主要是生产重组蛋白质类药物
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微生物表达系统
14.1.1 大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛、无芽孢、一般无荚膜。 裂殖。