表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。

2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。

3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。

4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。

5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。

6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。

8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。

9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。

（凝胶完全聚合需30-60min）2、积层胶（4%）的配制：ddH2O 1.4 ml30%储备胶 0.33 ml1M Tris-HCl 0.25 ml10%SDS 0.02 ml10%AP 0.02 mlTEMED 2 μl将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。

（三）上样: 取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。

（三）电泳:在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。

（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。

（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。

（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。

室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

表达蛋白的分离与纯化大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。

现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。

分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。

必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。

正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。

所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。

目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。

可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。

一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）（一）试剂准备采用T7· Tag Affinity Purification Kit1．T7·Tag抗体琼脂。

2．B/W缓冲液：4.29mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.7 mM KCl，3.0.137mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3。

4. 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸，pH2.2。

5. 中和缓冲液：2M Tris，pH10.4。

1. PEG 20000。

（二）操作步骤1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。

2. 重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。

3. 将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。

4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。

5. 10ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。

6. 用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。

7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。

8. 用PEG 20000浓缩蛋白。

（三）注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。

二、包涵体的纯化包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。

包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。

细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。

包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。

包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。

（一）试剂配制1．缓冲液A：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100mM NaCl。

2．缓冲液B：50mM Tris-HCl（pH8.0）,1mM EDTA,100 mM NaCl,1%NP-40。

3．缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl （pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100(V/V,4M脲素。

4．缓冲液Ⅱ：50M Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,3% Triton X-100 。

1．缓冲液Ⅲ：50mM Tris-HCl（pH8.0）,2mM EDTA,100 mM NaCl,0.5%Triton X-100,2M 盐酸胍。

5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100 mM Tris-HCl（pH8.0），2mM EDTA及脱氧胆酸钠。

（二）操作步骤1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）, 离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。

2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。

3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g 离心收集包涵体沉淀。

4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。

将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。

5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。

表达蛋白的生物学活性的检测一、MTT比色法检测细胞活性（一）原理活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。

对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。

（二）试剂准备1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中, 抽滤除菌。

2、 L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。

3、 MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。

4、 SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。

5、 L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。

6、 L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。

（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。

2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。

3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。

4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。

5、 37℃ 5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。

6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。

7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。