2006 年《分子生物学实验技术》实验内容RT-PCR（一）总 RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。

为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。

8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- FreeWater）将RNA 溶解并于-20℃保存。

注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

二）反转录实验安排：每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样μl4 5× Bufferμl6dNTPsμl1RNA 酶抑制剂μl1Oligo （dT）μ随机引μ反转录AMV1μ提取RNA6总体μ201h42反应条件：℃注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。

如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。

dNTPsBuffer 加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。

3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。

℃，以防酶失活。

4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20PCR（三）实验安排：每人做一管。

：按下列顺序加样μ l）反应体系（50ddHO 32.7 μl 2510×PCR Buffer μl4μldNTPs2P1 μl2μlP20.3Taqμl4cDNA template μlμl50Total反应程序：预变性94℃2min30s 变性94℃45s 退火50℃1min 延伸72℃30 cycles10min ℃ 72 终延伸PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳TBE(10×)的配制：1、电泳缓冲液，定溶至1000ml。

，并加入称取Tris-base 54g，硼酸27.5g0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 、1.5% 琼脂糖凝胶的配制：2加100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10TBE 缓冲液，并加水定容至称取 1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子EB(10mg/ml) 热溶解后加入5μ l 即可用于电泳。

3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μ l 产物5μl 与Loading Buffer 1 取PCR 电流进行电泳，约100V DL2000 DNA Marker 作对照，以电压，50mA 品孔旁加入 5 μ l 15min 后于紫外灯下观察结果。

注意事项：、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。

1 的试污染的手套随意拿其它无EB、禁止将盛有2EB 的器皿随意乱放，且不要戴有EB 剂或仪器。

产物的纯化(四) PCR实验安排：Gel 产物合并后作为一管，用PCR 产物回收试剂盒( E.Z.N.A. 每两人的PCR DNA 。

)回收目的Extraction Kit操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好、1PCR产物经 1.5% 管中。

1.5ml Ep重量的空管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。

Ep、将装有胶粒的2．3、按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer ，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep 管2－3 次，使胶粒完全溶解。

4、将上述溶胶液加入到HiBind spin -column 中，10000× g 离心1min ，弃去收集管中的液体。

5、加入300μl Binding Buffer ，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。

6、加入750μl SPW Buffer，静置2min，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。

7、重复步骤6。

8、空管10000×g 离心1min，以弃去DNA 回收柱中的残余液体。

9、将DNA 回收柱放入新的 1.5ml Ep 管中，并加入30μ l DNA Elution Buffer 至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA ，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。

注意事项：1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH 升高而降低DNA 的产量。

2、在切下含目的DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜(如一次性手套) ，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。

3、切胶过程要尽可能短，防止DNA 在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA 的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。

4、DNA 的洗脱效率与Elution Buffer 的pH 有关，因此用ddHO 洗脱DNA 时，应调节2ddHO 的pH 值至8.0。

2二、基因的克隆（一） DNA片断与载体的连接本实验做PCR 回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。

TA克隆原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T 载体是一种带有3'T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR 产物的克隆和测序。

实验安排：每两人做一管。

反应体系（10μ l）：Ligation Solution I 5μlPCR 回收产物 4.5μlpMD -18T vector 0.5μlμl 10 总体积以上16℃ 4h 反应条件：（二）感受态细胞的制备实验安排：每人做一管。

试剂配制：：液体培养基（Luria-Bertani）、1LB 去800mlNaCl 10g，溶于称取蛋白胨（Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeast extract） 5g，分钟。

高压下蒸气灭菌20 加去离子水至总体积1升,NaOH离子水中，用调pH 至7.5,溶液：、0.1mol/L CaCl22m0.22μ定容至100ml，高压灭菌或称取 1.11g CaCl （无水，分析纯），溶于超纯水中， 2 滤膜过滤除菌。

3、无菌甘油：100ml，高压灭菌即可。

取甘油（无菌操作）：操作步骤液体培养基中，2ml LBDH5 α的平板上挑取一个单菌落，接种于1、从生长有大肠杆菌振荡培养过夜，作为一级种子。

℃200r/min37 振荡培养200r/min℃ 50 比例无菌转接到5ml LB 液体培养基中，371: 2、将一级种子按0.5达到左右。

约2h-3h，至细菌的OD600 30min。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的 1.5ml Ep管中，冰浴，弃上清。

离心4000 r/min10min4、4℃ 。

－30min0.1mol/L CaCl、加入1ml 冰预冷的重悬沉淀，继续冰浴15min52 10min，弃上清。

℃ 4000 r/min 离心6、4 悬浮的感受态细胞可直接用轻轻重悬。

用冰预冷的0.1mol/L CaCl2007、沉淀中加入μ l2℃保存管，-70/10015%于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为，分装μ l 备用。

注意事项：1、细胞生长状态：不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中取适量在LB 固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。

2、细胞生长密度：以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 来控制。

6007OD 菌株的DH5 α个/ml 左右（不同菌株情况有所不同，细胞密度在5×10）为0.5600 时比较合适。

密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。

3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl 等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最2好于-20℃分装保存。

（三）连接产物的转化实验安排：每人做一份。

试剂配制：1、氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：用灭菌的ddHO将氨苄青霉素粉配成100mg/ml 水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌 2 后，置-20℃保存备用。

＋）：、LB 液体培养基（Amp2在LB 液体培养基中加入1μl 100mg/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。

＋）：固体培养基（LBAmp 3、在LB 液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸气灭菌20min。

待培养基温度降至50℃左右，加入1μl 100mg/ml 的氨苄青霉素母液后，铺制平板。

待培养基凝固后，于4℃保存备用。

操作步骤：1、取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μl ，轻轻混匀，冰浴30min 。

2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min 。

3、加入400μl LB 液体培养基，37℃ 200r/min-220r/min 振荡培养45min 后，以恢复质粒的抗性。

4、4℃ 4000r/min 离心5min，弃去上清400μl ，将剩余的100μl 菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。

注意事项：1、质粒的浓度：转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。

一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。

3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。

对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。

对照组2：以质粒代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应出现大量菌落。