提取目标质粒
对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR仪
PCR或RACE
Taq酶、薄壁管、矿物油
电泳仪器
琼脂水平电泳
琼脂糖
凝胶成像系统、手提紫外灯
长波紫外观察箱
PCR回收试剂盒
胶回收试剂盒
恒温水浴锅、离心机
分子生物学实验
对于通过PCR技术获得的目标基因 （续）
纯化产物
测序仪
PCR产物测序 T载体、平末端载体连接 低温冰箱
超低温冰箱
长期保存
分子生物学实验
卵细胞mRNA的提取、纯化
200℃ 烘箱
Oligotex系列试剂盒
细胞裂解
旋涡混匀器 离心机
匀浆 去蛋白和细胞残渣
DEPC 、 RNase-free DNase I 、
RNase-free 耗材
恒温水浴锅
温浴并结合
离心机、旋涡混匀器
洗脱
去盐和回收
分子生物学实验
目标片段的克隆和分析
分子生物学实验
DNA、RNA的提取、纯化和分析
• 包含有目标基因的质粒的获得 • 水稻基因组DNA的提取、纯化和分析 • 水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析
分子生物学实验
包含有目标基因的质粒的获得
• 对于通过筛库技术获
得的目标基因
• 通过噬菌体载体的自
切割作用生成目标质 粒
• 对于通过PCR技术获得
• 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时
后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并 印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行 杂交
分子生物学实验
利用PCR技并通计通用引物和GSP，通过5’RACE和 3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并 通过电泳、凝胶成像系统检测
的目标基因
• 通过回收纯化后利用T
载体等克隆并转化细 菌
• 铺板培养后通过蓝白
斑，原位裂解杂交分 离出含有目标质粒的 单个菌落
分子生物学实验
对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR或RACE
电泳
凝胶成像系统
长波紫外观察箱
切胶
胶回收试剂盒
T载体、平末端载体 转化细菌并铺板培养
筛选目标菌落
分子生物学实验
蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定 量
• 免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫
反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织 细胞内的表达和定位
• 蛋白质芯片系统
分子生物学实验
基因转化实验和转基因结果分析
• 转基因载体的构建：载体、农杆菌、特殊
抗生素
• 植株的转化：叶盘转化法、基因枪 • 植株的筛选：荧光检测、GUS染色、PCR法 • 基因功能分析：激光共聚焦显微镜、FISH
• 自动核酸/蛋白纯化工作站
分子生物学实验
目标蛋白功能分析
• 抗体的制备：多抗、单抗 • DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、
蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等
• 蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交
系统、噬菌体表面展示技术等
分子生物学实验
蛋白体内表达研究
• Western blotting：利用抗原-抗体反应，对
片段。利用化学方法或电转化仪等手段转 入细胞表达
• 体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解
物、小麦胚芽提取物等
分子生物学实验
表达蛋白的纯化
• SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰
胺胶分离不同大小的的蛋白。
• 利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和
树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白， 利用亲和层析洗脱出目标蛋白
等
分子生物学实验
部分分子生物学实验必需仪器
•
纯水仪
•
移液器
•
pH计
•
电子天平
•
生化培养箱
•
灭菌锅
分子生物学实验
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/10
分子生物学实验
• 质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利
用过滤柱纯化出质粒DNA
• 质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制
性内切酶在水浴锅中进行酶切
• 电泳，用凝胶成像系统分析 • 测序
分子生物学实验
水稻基因组DNA的提取、 纯化和分析
• 利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂
盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离 子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质 的原理提取基因组D体载体自切割或T-Vector、平末端
载体克隆获得目标质粒
• 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因
测序
分子生物学实的合成
RTase、RNase抑制剂
• 利用酚-氯仿抽提hern blotting检
测目标基因的拷贝数
分子生物学实验
水稻各器官Total RNA的提取、纯化 和分析
• 分离所需的水稻各器官组织，并利用
Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA： 将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA
超净工作台、电转化仪
感受态细胞、培养基、
细菌转化、铺板培养
抗生素
杂交箱、恒温摇床、低温冰箱
蓝白斑筛选、菌落原位杂交
X-gal、IPTG、 尼龙膜和探针
离心机、恒温水浴锅
质粒提取、酶切分析、测序 限制性内切酶
分子生物学实验
质粒提取、分析
• 常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出
质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙 醇沉淀质粒DNA
基因表达
报告基因载体
体外转录 翻译
真核转录
蛋白分析
蛋白
蛋白分离
基因转化 报告基因检测
分子生物学实验
分子生物学主要实验流程
• 实验起始材料的选取和准备 • mRNA的提取、纯化 • 目标片段的克隆和分析 • DNA、RNA的提取、纯化和分析 • 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功
能分析
• 基因转化实验及转基因结果分析
用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文 库目标基因的筛选
• 利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出
目标基因
• 通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的
目标基因
分子生物学实验
通过核酸杂交和免疫反应筛库
• 将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙
膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中 利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗 膜（探针标记：放射性和非放射性）
分子生物学实验
2020/11/10
分子生物学实验
细胞调节
分子生物学实验概述
生物样品（细胞、组织、细菌）
神经科学
分子诊断
DNA分离
RNA分离
DNA测序 DNA标记
质粒DNA 基因组DNA 噬菌体DNA
总RNA mRNA cDNA
重组DNA
PCR
遗传鉴定
突变
基因表达 分子生物学实验
分子生物学实验概述（续）
分子生物学实验
实验起始材料的选取和准备
组织器官
常规材料
原生质体\细胞 细菌\真菌\酵母
特殊材料 少量起始材料 特殊病变组织
亚细胞结构
分子生物学实验
实验起始材料的选取和准备
人工气候箱、制冰机
分离准备工作
超净工作台、显微操作系统
水稻卵细胞的分离
RNase-free 耗材、液氮罐
材料的速冻
RNase 抑制剂
PCR仪
第二链的合成和扩增
高保真Taq酶
恒温水浴锅、离心机
酶切、纯化和片段分离 限制性内切酶、过滤柱
电泳仪器、凝胶成像系统
cDNA检测
琼脂糖
恒温水浴锅
插入载体并包装
超净工克隆
• 利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利
• 在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电
泳检测总RNA的质量
• 利用特异性的探针，通过Northern blotting
检测目标基因在各器官的表达情况
分子生物学实验
Southern blotting和Northern blotting
Southern blotting
限制性内切酶、恒温水浴锅 基因组DNA完全消化
荧光
荧光扫描 成像系统
分子生物学实验
克隆化基因的表达及表达蛋白的纯 化和功能分析
•
克隆化基因的表达
•
表达蛋白的纯化
•
功能分析
分子生物学实验
克隆化基因的表达
• 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的
反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一 致的DNA片段（通过测序确证）
• 体内表达：选择合适的表达载体插入目标
探针制备
同位素检测仪
手提紫外灯、电泳仪器
琼脂水平电泳
比活性测定 探针制备试剂盒
真空转膜仪 紫外交联仪
印迹转膜 DNA交联
尼龙膜
分子生物学实验
Southern blotting和Northern blotting （续）
制备好的尼龙膜
探针（放射性或非放射性）
杂交箱
杂交
同位素检测仪 磷屏成像系统
放射自显影