实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。

由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。

同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。

本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。

学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。

本实验采用CTAB 法，其主要作用是破膜。

CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。

植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。

CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。

核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。

纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。

[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。

（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。

）7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。

沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。

边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

9、将粗制品溶于TE缓冲液。

10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

[注意事项]1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

[思考题]1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？2、液氮研磨的原理是什么？实验2 质粒DNA的提取和酶切质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。

质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。

由于质粒比较小，并且能进行独立的自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

限制性内切酶（Restriction enzyme，RE）是在细菌内发现的细菌降解外来DNA的保护机制。

由于限制性内切酶通过识别特定的核酸双链序列并在特定的位点切断磷酸二酯键。

不同的限制性内切酶识别的序列不同。

[实验目的]通过本实验掌握碱裂解法提取质粒和限制性内切酶酶切的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

限制性内切酶通过识别特定的DNA序列并在特定序列的特定位点打开磷酸酯键。

[实验器材]1、恒温培养箱2、恒温摇床3、台式离心机4、高压灭菌锅5、Tip头、Eppendorg管6、含有目的质粒的E.coli菌株[实验试剂]1、溶液I50mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）2、溶液II0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合3、溶液III5mol/L乙酸钾60mL冰乙酸11.5mL水28.5mL4、TE缓冲液10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA(pH8.0)5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）6、EcoR I 及其缓冲液7、Hind III及其缓冲液[实验步骤]1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。

7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。

12000r/min离心5min。

倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

12、20μL TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

13、取4μL所提取的质粒DNA，加入1μL酶切缓冲液，EcoR I或Hind III 1μL，用超纯水补至总体积10μL。

37℃保温2h以上。

14、酶切样品待琼脂糖电泳检测。

[注意事项]操作时，避免剧烈震荡。

[思考题]1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？2、SDS和NaOH的作用是什么？[参考文献]《精编分子生物学实验指南》（第四版）[美] F M奥斯伯，R E 金斯顿等主编科学出版社2005图pBluescriptII SK质粒载体实验3 PCR基因扩增PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明的聚合酶链反应。

这一技术具有划时代意义的。

其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

[实验目的]学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。

[实验原理]多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。

在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

1、变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2、退火：使溶液温度降至50~60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

3、延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

[实验器材]1、PCR热循环仪2、tip头、冰盒3、PCR管4、超纯水5、DNA相对分子质量标准物6、移液枪[实验试剂]1、10×缓冲液500mmol/l KCl100mmol/l Tris·HCl(pH8.3 ,室温)15mmol/l MgCl20.1% 明胶2、4×dNTP1mmol/l dATP1mmol/l dCTP1mmol/l dGTP1mmol/l dTTP3、Taq酶5U/μL4、DNA模板1ng/μL5、引物1 、引物2引物溶液浓度10pmol/μl[实验步骤]1、在PCR管内配制20μL反应体系：反应物体积/μL10×buffer 2.0dNTP 1.0引物1 1.0引物2 1.0Taq酶0.5Template 1ddH2O 13.5总体积202、按下列程序进行扩增：①、95℃预变性5min②、95℃变性1min③、55℃退火1min④、72℃延伸1min⑤、重复步骤②~④30次；⑥、72℃延伸10min3、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果配制0.7%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。

保持电流40mA。

电泳结束后，紫外灯下观察结果。

[注意事项]1、PCR加样时，尽量保持低温操作，避免酶失活和模板、引物降解。

3、取样时注意不要污染药品。

[思考题]1、什么是引物二聚体？出现引物二聚体的原因是什么？2、PCR仪的热盖设置有什么优点？[参考文献]1、《PCR技术操作和应用指南》主编林万明人民军医出版社1995年2、《PCR技术实验指南》[美]C.W.迪芬巴赫G.S.德维克斯勒科学出版社2003年实验4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是D-半乳糖-3,6-L 半乳糖。