不同脱钙条件对骨组织免疫组织化学染色抗原性的影响浅析
摘要目的分析不同脱钙条件对骨组织免疫组织化学（免疫组化）染色抗原性的影响。
方法用8%硝酸分别于微波、光波及光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ的条件下对骨组织进行脱钙，并将室温（20℃）条件下脱钙的骨组织作为对照组，运用链霉菌素卵白素-生物素（LSAB）免疫组化染色技术，并对其染色效果进行分析比较。
结果微波、光波、光波+微波组合Ⅰ及光波+微波组合Ⅱ的脱钙时间显著低于对照组，且免疫组化染色效果显著优于对照组（P＜0.05）；光波+微波组合的免疫组化染色效果显著优于微波、光波（P＜0.05）；但微波与光波之间、光波+微波组合Ⅰ与光波+微波组合Ⅱ之间的免疫组化染色效果比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
结论光波+微波组合脱钙时间要明显短于微波、光波及室温脱钙，且具有良好的免疫组化染色效果。
关键词脱钙条件；骨组织；免疫组织化学染色；抗原性
【Abstract】Objective To analyze influence by different decalcification conditions on bone tissue antigenicity in immunohistochemical staining. Methods Decalcification was made through 8% nitric acid under microwave，light wave，light wave + microwave Ⅰand light wave + microwave Ⅱin bone tissue. Decalcification under room temperature （20℃）was taken as control group. Labelled streptavidin biotin method （LSAB）immunohistochemical staining was applied to analyze and compare stain effects. Results Decalcification time under microwave，light wave，light wave + microwave Ⅰand light wave + microwave Ⅱwere all shorter than control group，and their immunohistochemical staining effects were all better than control group （P＜0.05）. Light wave + microwave had better immunohistochemical staining effects than single microwave or light wave （P ＜0.05）. There was no statistically significant difference of immunohistochemical staining effects across microwave，light wave，light wave + microwave Ⅰand light wave + microwave Ⅱ（P>0.05）. Conclusion Light wave + microwave provides shorter decalcification time than microwave，light wave and room temperature，and it contains good immunohistochemical staining effect.
【Key words】Decalcification condition；Bone tissue；Immunohistochemical staining；Antigenicity
目前，免疫組化染色技术是临床病理鉴别及诊断的重要手段，骨组织由于含有丰富的钙盐，因此其免疫组织化学染色自然与常规石蜡切片有所区别，通常需要先去除钙盐后才可制成比较薄的切片，然后再进行常规脱水、透明处理等操作[1]。
本研究旨在分析探讨不同脱钙条件对骨组织免疫组化染色抗原性的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 材料选取2012年4月～2015年8月骨外科送检的人骨组织，脱钙液为硝酸10 ml+蒸馏水190 ml制成的硝酸液。
Panasonic NN-DF382M光波/微波炉1台，微波额定输入功率为1400 W，光波额定输入功率为1050 W，微波额定输出功率为900 W，额定输出频率为2450 MHz，输出功能共分为微波、光波及光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ。
微波输出功率为5个调节档，光波输出功率为单一光波管发光，光波+微波组合Ⅰ为微波输出时间的30%+光波输出时间的70%，光波+微波组合Ⅱ为微波输出时间的55%+光波输出时间的45%。
1. 2 方法将1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm的骨组织分别用8%硝酸分别于微波、光波及光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ的条件下进行脱钙。
将脱钙后的骨组织常规制成切片，经复合酶消化石蜡切片后，运用LSAB免疫组化进行免疫酶细胞化学染色。
1. 3 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件处理数据。
计量资料以均数±标准差（x-±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。
P ＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
微波、光波、光波+微波组合Ⅰ及光波+微波组合Ⅱ的脱钙时间显著低于对照组，且免疫组化染色效果显著优于对照组（P＜0.05）；光波+微波组合的免疫组化染色效果显著优于微波、光波（P＜0.05）；但微波与光波之间、光波+微波组合Ⅰ与光波+微波组合Ⅱ之间的免疫组化染色效果比较差异无统计学意义（P>0.05）。
见表1。
3 讨论
骨组织含有大量的钙，质地坚硬，一般不可直接进行制片染色，需要经过脱钙处理的特殊工序。
对病理活检苏木精-伊红染色（HE染色）的效果不会构成比较大的影响，但是在很大程度上会影响到免疫组化染色抗原性[2]。
近些年，微波辐射技术逐步深入应用到骨组织脱钙、免疫组化染色、抗原修复等，且效果突出，特别是EDTA快速脱钙、微波-低温硝酸等技术对最大化地保留脱钙组织的抗原性做出了重要的贡献[3，4]，而光波+微波脱钙到底对免疫组化染色抗原性的实际影响在文献报道中鲜见。
本组研究中光波-微波组合Ⅱ脱钙时间在集中脱钙方法中是最短的，而室温下的骨组织与切片呈现出淡黄色，脱钙时间最长。
就免疫组化染色效果来说，室温条件下的脱钙组织最差，微波、光波条件下的脱钙组织相对较好，光波+微波组合Ⅰ、光波+微波组合Ⅱ条件下的脱钙组织最好，主要是因为微波与光波的双重作用促使了骨组织的钙盐的反应速度进一步加快，使得过去的常规脱钙方法少至数小时多则几天的反应时间大大缩短以致在短时间内便可完成，因而最大化地保留了抗原性，提高了免疫组化染色的效果。
在光波+微波-硝酸脱钙的应用过程中应注意如下几方面：①微波与光波的双重作用会使得脱钙液温度在短时间内迅速升高，因此结合预冷降温措施可很好地减轻温度对抗原性的影响[5]。
②不宜使用金属容器盛装脱钙液，且要保证充
足的脱钙液量，通常情况上要达到标本的20～30倍左右，并要更换1～2次新液。
③骨组织厚薄适宜， 5 mm左右为最宜，以防脱钙时间过长而损及组织形态结构、影响染色效果。
综上所述，8%硝酸光波+微波组合脱钙时间要明显短于微波、光波及室温脱钙，且具有良好的免疫组化染色效果。
参考文献
[1]杨传红，赖晃文，唐云，等.微波快速脱钙及其脱钙液的选择. 临床与实验病理学杂志，2010，12（4）：357-358.
[2]刘海芳. HE染色切片褪色后免疫组化染色方法研究.中国现代医生，2011，49（17）：81-82.
[3]熊正文，李宏伟，黄勇，等.骨組织脱钙技术及在免疫组化染色中的应用研究.中国比较医学杂志，2011，14（3）：175-178.
[4]熊正文，朱光君，黄勇，等.骨组织的脱钙及其免疫组织化学染色技术探讨.中国组织化学与细胞化学杂志，2010，11（3）：347-349.
[5]张绪斌，熊正文，张华东.骨组织脱钙技术及其应用.医学理论与实践，2011，24（11）：1264-1267.。