骨组织电镜脱钙技术在免疫组化中的应用朱礼国，汤显斌，张健，赵伦华，程少华
【关键词】骨组织
［关键词］骨组织；电镜；脱钙
骨组织的免疫组化一直是病理技术中的一大难题。
由于骨组织中60％以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶，因此骨组织固定、脱钙都是制备标本的重要环节。
一些强酸如盐酸、硝酸等虽能快速有效除去骨组织中的钙盐，但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏［1，2］;近几年进展的微波辅助EDTA脱钙技术［3］，尽管可实现较好地爱惜组织抗原性且快速的成效，但操作程序复杂。
骨组织的电镜制片技术对组织固定与脱钙要求均远高于常规染色与免疫组化，其脱钙液与固定液均与其他方式有较大不同，本实验用该方式进行骨组织免疫组化，取得了较理想的成效，现报导如下。
1 材料与方式
1．1 材料
健康成年日本大耳白兔60只，体重±0．25)kg，雌雄不限，
依如实验要求分为对照组与对照组；由武汉大学动物实验中心提供。
一抗为兔VEGF单克隆抗体，美国Neo Markers公司(Ab3，JH121)；二抗为鼠抗兔VEGF单克隆抗体，迈新公司(KIT9701SPMouse)试剂盒。
1．2 固定液配制
固定液配方如下：多聚甲醛2 g，蒸馏水25 ml，lN氢氧化钠1滴~3滴，25％戊二醛10 ml，依次加入后加入0．2 mol磷酸缓冲液至50 ml［4］。
1．3 脱钙液配制
脱钙液配方如下EDTA2 Na 40 g~50 g，蒸馏水500 ml， g NaOH 350 ml，再加蒸馏水至1 000 ml［4］。
1．4 组织处置程序
实验终止后处死大白兔，取后腿骨，将股骨头沿正中冠状面劈开，然后将其截成0．5 cm×0．3 cm× cm大小骨片，生理盐水清洗后当即投入强冷后固定液中，4 ℃固定12 h~24 h；固定终止后骨片在0．2 mol磷酸缓冲液中充分漂洗后，投入脱钙液中，4 ℃下脱钙，每日检查脱钙情形，直至骨片脱钙完全为止，密质骨大约3周~4周，
松质骨约7 d~10 d;脱钙终止后，骨片用蒸馏水冲洗20 min，然后进入常规脱水处置程序并包埋、切片。
免疫组化
依照试剂盒说明，进行常规SP免疫组化操作。
2 结果
正常兔股骨头VEGF免疫组化染色以胞浆和(或)胞膜、核膜有明确棕黄色着色者为阳性细胞，VEGF阳性部位要紧位于胞浆，(见图1)。
实验组动物股骨头中可见成骨母细胞呈多层粘贴在骨小梁表面，并成批演化为骨细胞，同时在染色阴性的区域显现点状新生的毛细血管(见图2)，所有切片染色均无背景，阳性病例显色强，定位准确。
3 讨论
免疫组化成效好坏关键取决于抗原维持的结果，这就需要在组织制片进程中将抗原最大程度地爱惜好。
因骨组织含有大量的钙盐，组织较致密，在制片前要延长固按时刻并经历漫长脱钙处置进程，而大多数酸性脱钙液对抗原均有破坏作用，而且脱钙时刻太长又进一步无益于抗原性的爱惜。
鉴于上述缘故，强酸快速脱钙在骨组织免疫组化中已被弃用。
近些年显现的微波(MW)-EDTA快速脱钙技术虽可使脱钙时刻缩短为8 h~10 h［5］，但操作程序比较复杂，脱钙时需较好地
操纵脱钙液温度不能超过15 ℃，不然也易致使假阴性，背景色深等缺点［6］。
因此，在时刻要求不紧迫的前提下，该方式也不该是首选。
电镜制片进程中由于要极大程度地保留组织的超微结构，因此骨组织的电镜制片进程中必然最大限度地爱惜抗原不受破坏，从而对免疫组化大有裨益；本实验中固定液中含有多聚甲醛与戊二醛，前者具用较强的穿透力，能够缩短固按时刻，而戊二醛对蛋白及糖原有较好的固定作用，且在4 ℃条件下进行固定，如此最大程度地减少了组织自溶与抗原弥散；脱钙液中要紧成份是EDTA，其脱钙作用较温和，对组织没有损伤；因该步骤时刻较长，必需尽可能去除脱钙液中一切可能对组织有破坏作用的因素。
脱钙液中少量NaOH就起到中和残留在组织中的固定液中的酸性物质，另外脱钙液的温度也是阻碍抗原性维持的重要因素，尽管高温有利于缩短脱钙时刻，但会加速抗原弥散，因此在4 ℃条件下进行脱钙是适合的选择。
经本方式固定、脱钙后的骨组织用于免疫组化的最大优势是最大限度地爱惜了组织的抗原性，因此取得了比较完美的结果。
参考文献：
［1］朱小兰，张威，骆新兰，等．216例骨髓脱钙时刻的探讨［J］．临床与实验病理学杂志，2003，19(6)：663.
［2］韩永，徐燕杰，李宁．骨及钙化组织术中冷冻切片的制
片方式［J］．临床与实验病理学杂志，2003，19(5)：516．
［3］Chang W,Tu C,Chen TH,et and signal transduc2 tion of calcium2sensingreceptors in cartilage and bone［J］.Endo2 erinolgy，1999，140(12)：.
［4］席越，王戈平，黄啸原．骨组织病明白得剖学技术［M］.第1版．北京：人民卫生出版社，1997：162164．
［5］熊正文，黄勇，胡海霞，等.微波EDTA脱钙技术在免疫组织学染色中的应用研究［J］.华北国防医药，2003，15(3)：1012.
［6］吴鸿雁，王景美，郑金榆.免疫组化染色中骨组织脱钙方式［J］.临床与实验病理学杂志，2005，20(3)：358．。