不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用
【摘要】目的比较不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力的差异，探讨其对HE染色的影响。
方法选取50例手术切除的新鲜骨标本，运用4种常用的脱钙液(14%硝酸、10%盐酸、20%甲盐酸和EDTA脱钙液)进行脱钙，比较其脱钙效果和对HE染色的影响。
结果不同的脱钙液对骨组织的脱钙能力、HE染色效果影响有显著区别。
结论14%硝酸脱钙能力最强，用时间最短，染色的效果最差；10%盐酸对骨组织的损伤小，HE染色的效果最好，但用时较长；20%甲盐酸脱钙能力和HE染色效果都介于10%盐酸和EDTA脱钙液之间；EDTA脱钙液脱钙用时最长, 对骨组织的损伤最小。
【Abstract】Objective To investigate the different ability of four different decalcifying solutions to decalcify and their influence of HE stain and immunohistochemistry. Methods 50 cases of fresh human bone example are selected. The bones had been decalcified with four kinds of decalcifying solution (including 14% nitric acid, 10% hydrochloric acid, 20% a hydrochloric acid and EDTA). Results Different decalcifying solutions had the different decalcified ability and the influence of HE stain and immunohistochemistry. Conclusion 14% nitric acid can decalcify strongly and rapidly. But its deficiency is the infection of HE coloration and immunohistochemistry. 10% hydrochloric acid doesn’t destroy the tissue and has the best influence for HE stain. The effect of 20% a hydrochloric acid and HE stain between 10% hydrochloric acid and EDTA decalcifying acid. EDTA can decalcify for a long , have the minimum damage for bone tissue.
【Key words】Decalcifying solution; HE stain; Bone tissue
骨组织是一种坚硬的结缔组织，由骨细胞和骨基质组成，骨基质内含大量无机盐，主要是羟磷灰石-磷酸钙和碳酸钙。
由于磷酸钙和碳酸钙的存在造成骨组织的硬度较大，不易切片且极易脱片，因此在病理制片过程中，必须要进行脱钙处理，但如果骨组织脱钙过度又会严重影响组织细胞染色效果，或使组织抗原丢失，从而影响对病变组织的病理诊断或科学实验工作。
因此，必须寻找一种合适的脱钙液进行骨组织脱钙。
现时的脱钙液有无机酸(硝酸、盐酸、硫酸)和有机酸(蚁酸、醋酸、甲酸等)，也可以利用电解、微波等进行物理脱钙，或混和使用［1］。
本研究希望通过对比各种脱钙液的脱钙效果及其后HE染色和免疫组化效果，探讨既方便临床应用，又适合科学研究的脱钙方法。
1 资料与方法
1.1 标本
选取2008年1月至2008年8月我院手术室送检的手术标本50例，其中有长骨、短骨、不规矩骨，包含骨干和骨端的骨皮质、骨髓质。
1.2 材料与设备
所有化学试剂均由广州化学试剂一厂生产；切片机、染色机和切片刀片均由英国shandan公司生产。
1.3 脱钙液的配制
14份浓硝酸加86份自来水配制成14%硝酸；10份浓盐酸加90份自来水配制成10%盐酸；盐酸20 ml,甲酸20 ml,自来水100 ml,配制成20%甲盐酸；EDTA 二钠盐10 g，PBS溶液100 ml(滴加NAOH溶液至溶解，然后用HCL中和至pH 7.0)配制成EDTA脱钙液。
1.4 步骤
每例标本平均分成4份，确保所有骨组织的性质都一样。
新鲜骨组织及时用10%中性福尔马林水溶液固定。
充分固定后，用锋利的钢锯将骨组织切成小块，大小约1.5 cm×1.5 cm×0.3~0.5 cm,厚0.3 cm~0.5 cm，然后充分浸泡在不同脱钙液中，间隔一定时间后更换脱钙液，当用缝衣针顺利穿过无阻力感、手术刀可顺利切开即为脱钙成功。
继而进行常规脱水、石蜡包埋、HE染色。
2 结果
2.1 脱钙效果14%硝酸最好。
14%硝酸＞10%盐酸＞20%甲盐酸＞EDTA脱钙液(见表1)。
2.2 脱钙时间14%硝酸时间最短。
14%硝酸＞10%盐酸＞20%甲盐酸＞EDTA脱钙液(见表1)。
2.3 对组织损伤EDTA脱钙液对骨组织的损伤最小，对组织损伤：EDTA脱钙液＜10%盐酸＜20%甲盐酸＜14%硝酸(见表1)。
2.4 切片质量14%硝酸切片质量最好。
EDTA脱钙液切片质量最差，骨组织中钙盐残存，出现“返砂”现象，切片在镜下或肉眼可见非常明显的“刀痕”现象，甚至影响观察(见表1)。
2.5 脱钙后HE染色的效果10%盐酸脱钙后HE染色的效果最好，细胞核与细胞质层次分明，对比清晰，颜色鲜艳。
其余脱钙后HE染色的效果14%硝酸＜20%甲盐酸＜EDTA脱钙液(见图1)。
图1
A.14%硝酸;
B.10%盐酸;
C.20%甲盐酸;
D.EDTA脱钙液
3 讨论
脱钙是骨组织制片中的重要一环，也是病理技术难点，而脱钙剂的选择尤其重要。
14%硝酸脱钙液是目前临床使用最广的一种脱钙液，主要是因为其脱钙能力最强，脱钙时间最短，但这也使得骨组织的脱钙程度较难掌握，往往造成过度脱钙。
同时，14%硝酸的渗透能力差，对骨组织特别是比较硬的骨组织渗透能力更差，导致其对不同组织的渗透程度不相同，脱钙效果不一样，部分标本出现“返砂”现象，制片易出现明显“刀痕”现象，影响观察。
另外，14%硝酸脱钙液对组织的损伤最大，脱钙后组织肿胀明显，组织细胞的形态结构难以保持完整清晰。
由于14%硝酸为强酸,脱钙后细胞核的染色能力下降,切片经常规HE染色后细胞核着色能力下降而返蓝困难而变成淡红色,对比度差。
此外，强酸在溶解骨组织钙盐的同时也容易破坏抗原物质, 使得抗原的免疫活性降低，在免疫组化染色中抗原不能有效表达，往往造成假阴性。
10%盐酸脱钙液处理后的骨组织软硬适中，脱钙充分，常规脱水包埋切片无龟裂，刀痕少,无“返砂”现象，切面光滑无皱缩脱落；HE染色后在光学显微镜下观察苏木素、伊红现象色对比清晰，染色均匀无发白，细胞核无皱缩和肿胀变形；但脱钙时间较长，对于比较硬的组织脱钙时间会更长，限制其临床应用。
20%甲盐酸脱钙液的酸性较温和，脱钙彻底干净，对组织损伤性少，脱钙后组织不变色仍保持组织原来的光泽。
脱钙效率显著提高, 制作出的切片用于HE 染色及免疫组织化学研究, 都能得到优良效果，免疫组织化学染色能理想地显示抗原物质,免疫组化阳性反应物为棕黄色,定位明确, 组织切片背景干净。
由于EDTA 是一种优良的脱钙螯合剂, 故EDTA脱钙液的脱钙作用优于酸性溶液, 对组织破坏极小, 能保持组织细胞的完整结构, 尤其细胞显微化学改变甚微,且能保存组织中的抗原物质和某些酶类的活性，有利于组织免疫组化和组织化学染色，从而更进一步地保证了实验结果的精确性［2］。
EDTA脱钙液脱钙作用较缓慢，一般要4~5周，大多要5~6周，脱钙温度以常温为宜，可加温至37°C快速脱钙，但脱钙效果不理想［3］。
另外，EDTA脱钙液在使用过程中还需注意不宜用金属容器，尽量用玻璃容器；同时，组织经过脱钙后必须在流动的自来水充分冲洗，自来水的弱碱性可中和残留在组织中的脱钙液酸性，有利于组织切片苏木素的着色，同时由于脱钙对组织细胞或多或少都有影响，苏木素染色可以适当延长时间以保证苏木素着色。
参考文献
［1］王伯云,李玉松,黄高升,等.病理学技术.北京;人民卫生出版社,2000：943.
［2］刘大维,初同伟,张良,等.EDTA微波脱钙骨的免疫组化染色.第三军医大学学报,2003,25(1):77-78.
［3］黄美雅,黄云梅,林燕萍,郑良朴.EDTA脱钙方法的实验观察.福建中医
药，2007，38(4)：46-47.
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。