甘露聚糖酶活性测定方法
一．原理
样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。

二．定义
一个甘露聚糖酶活性单位（MNU）被定义为：在测定条件下，1秒钟内从甘露聚糖中产生1 nmoL相应还原糖－甘露糖所需的酶量（1 MNU=1 nkat）。

三．适用范围与安全性
本方法适用于来源于木霉属（Trichoderma）的甘露聚糖酶样品的测定。

当检测其它来源的酶活时，本测定方法的直线性需要校正。

本测定方法中的DNS试剂在吸入后，接触皮肤和眼睛，或被误服后，对人体有害。

四．试剂与仪器
所有试剂溶液均用去离子水配制。

1. 柠檬酸缓冲液（0.05M,pH5.3）
溶解10.5 g柠檬酸（C6H8O7·H2O）于800mL水中，并用1M氢氧化钠调节pH至5.3（消耗约110mL），再用水定容至1000mL。

2. 底物－0.3%
称取0.6 g刺槐豆胶（Sigma G-0753），溶于约80℃的柠檬酸缓冲液中，磁力搅拌，加热至沸腾，继续搅拌冷却至室温，加盖缓慢搅拌过夜。

将不溶的沉淀物离心（1000rpm离心10min），并用柠檬酸缓冲液定容至200mL。

将此底物溶液在-20℃下冰冻保存。

临用前，将底物溶液在沸水浴中缓慢溶解至80℃左右后使用。

3. DNS试剂
溶解50.0 g3,5-二硝基水杨酸（Sigma D-0550）于4000mL水中，不断磁力搅拌，缓缓加入80.0 g氢氧化钠，使之完全溶解，再继续磁力搅拌，分数次少量加入1500 g四水合酒石酸钾钠，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃。

冷却至室温后定容至5000mL。

如果溶液不澄清，用Wheatman 1号滤纸过滤，然后室温保存于棕色瓶中。

4．仪器
恒温水浴锅50℃
恒温水浴锅100℃
试管旋涡磁力搅拌器
分光光度计
五．测定条件
底物半乳甘露聚糖
pH 5.3
温度50℃ 0.5℃
保温时间5min
六．样品处理
用柠檬酸缓冲液稀释被检样品。

调整稀释倍数使测定时产生的吸光度在0.10～0.40之间。

七．操作步骤
分别向2支试管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保温5min。

在其中一支试管中加入200μL稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置于50℃水浴中准确保温5 min。

加入3.0 mL DNS试剂至两支试管中，搅拌均匀。

在另一支试管（空白管）中加入200μL稀释酶样，同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。

于540 nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。

八．标准曲线制作
配制20mM甘露糖储备液。

将360 mg甘露糖[1]
（Sigma M-6020）溶解于柠檬酸缓冲液
中，并用缓冲液定容至100mL。

（葡萄糖标准品应置于干燥器内保存）。

储备液可等分成少量在-20℃下冰冻，使用前，融解并混合均匀。

用缓冲液稀释储备液配制以下标准稀释液：
储备液（mL）缓冲液（mL）甘露糖μmoL/mL 酶活[2]
MNU/mL
1.5 8.5 3 10
3 7 6 20
5 5 10 33.3
7 3 14 46.7
每种标准稀释液做2次重复测定。

向2支试管中分别加入1.8 mL底物溶液，50℃水浴保温5min。

加入3.0 mL DNS试剂和200μL标准稀释液，加入200μL柠檬酸缓冲液以代替标准稀释液配制试剂空白。

在沸水浴中准确保温5min，冷却后在540nm处测量样品对试剂空白的吸光度。

每批样品制备一次标准曲线。

注：
[1] ------------应保存在干燥器中。

[2] ------------甘露聚糖酶活性（MNU/mL）=甘露糖浓度（μmoL/mL）×1000/水
解时间（300s）
标准曲线：Y = a + bX
式中：
Y------------吸光度
X------------甘露糖浓度（μmoL/mL）
a------------截距
b------------斜率
九．计算公式
样品酶活（U/g）＝————————————————————请麦总转交黄小文老师!。