胶体金技术问：检测cle ，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T 线下降很多是由什么原因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。

我烘干用了一整天，30 多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。

我就是先3ml ，再10ml 。

T ：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。

重新试验，先小试，逐步放大。

这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml 的、10ml 的都做一下。

0 是啊，有时标记完检测后，T 线就下降（比预实验）T :标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。

你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。

0 如果我再调整pH 值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了T：通过其他途径提高灵敏度。

问：请问为什么C 线包被3mg/ml 不出现条带，而2mg/ml 的就有条带出现呢？T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。

NC 结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假设其结合能力仅仅为2mg ，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。

检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。

我主要指夹心法。

0 一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。

0 你们主要用什么方法摸索最佳PH 值？1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。

0 这样岂不是需要很多抗体？呵呵2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。

0 离心后现象，怎么样的是理想的？3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。

0 是啊，之前就发现有点贴壁和黑点，我延长了离心时间也没用。

4.小号金子1ml 离心几分钟就够了。

越大速度越低时间，这个速度和时间折中下自己调整。

问：不知道那些强假阳性有什么办法可以抑制？T：你加阻断剂试过没？0试过几种，没有效果，能阻断C线，对T线基本没阻断。

T：照这么说的话既然是同一对抗体而且胶体金法临床假阳性率这么高，我觉得你这对抗体可能对某种因素太敏感了吧，ELISA 是共价标记胶体金是物理标记是会有差异。

（涛）0 现在就是找不到原因，那强阳漏检呢？其实也有试过好几个抗体配对，基本都是那样的结果问：请教一下各位大虾，多抗标记的时候要注意哪些细节呢？T：尽量别标记多抗，实在是想标记多抗，把标记PH 提高点。

问：划线时的湿度条件是NC膜制备的要点之一，湿度应控制在45 %〜65%，有文献支持吗？T：文献呢是有滴，不过NC 供应商也会给你建议滴，你自己也是可以探索滴，最终都是要以产业化需要为准。

1.主要膜吸收蛋白的时候要是湿度太低会比较疏水，不利于吸收，一般在40% 以上，膜在点之前在这个环境下放置一定时间平衡一下。

0 点完的膜烘干后的湿度呢？是不是要低一点。

2.湿度不低，你怎么烘干啊。

0 呵呵，我的意思是已经烘干的板子拿出来切条时的湿度一般在多少啊。

没办法，我刚接触胶体金，现在公司在申报，委托的公司（艾伟德）给的资料很乱，前后都不对应。

问：谁知道MP 的HCV BLOT 3.0 哪有卖？T ：找丽珠吧，不过不一定卖给你，独家代理。

问：抗体灵敏度太高，有什么思路去降低灵敏度，从而达到规定的cutoof 值呢？1.反标，偶联抗原去标记，把抗体点T 线，同样的原料可以下降一个数量级的灵敏度。

T：THE ONE 说的对，从不公平竞争到公平竞争，灵敏度会下降比较明显的。

0 质控线没了？2.你不会用单独的质控系统的啊？rabbit IgG 和羊抗兔的多抗。

T：楼上说的对。

问：请教一下，Fusion5 用来包被时，需要进行处理吗？T：当然，是不可以直接使用的。

WHATMAN 有相关说明资料，丁香园上也有相应的文献翻译。

0 用作金标垫行吗？成本高不高？T ：当然高，Fusion5 有专用用途。

0 用在哪方面比较好？T：多方面，比如同时用做样品垫和金垫，改善CV ，比如某些高附加值数显产品，因其设计的需要。

这个材料有专用用途，用好了的话，效果是非常好的，小日本用的不错。

4. Fusion 5 性能非常优越，不信自己要点样品比较下。

问：各位前辈，请问你们谁知道HCV 的国家盘里面到底有哪些片段血清啊。

T：各个片段的都有一般NS3 片段的容易漏检最好单独再加上NS3 片段。

问：请教各位高手：免疫层析试纸中，PH 对信号强弱，反应特异性的影响是怎样的关系？T ：不可一概而论啊，最好哪个产品举个实例。

问：有问题请教，试纸条想大批量生产成产品，其中标记胶体金的单克隆抗体怎么大批生产呀？都是打小鼠吗？T ：可以外购啊。

0 但是我们做的抗体外面没有卖，我们已经做出来杂交瘤细胞株了，如果每次都打小鼠去腹水的话这其中批次的差别是不是有啊？T：只要细胞株一切正常的话，单位浓度下的单抗活性，批次间差异不大。

每次纯化，纯度多少会有点差异，批间差肯定是有的，不过正常来讲，不会对生产产生太大影响。

0 那我再标记的时候条件是不是还得重新摸索啊？T:不用，其实你的单抗生产岀来，肯定会做质检的。

0 就纯化好了之后，浓度测出来，然后就按摸索好的浓度标记就好了吗？T: 满足质检要求，成品生产工艺，就不用变。

你得先质检，万一细胞株有问题呢。

0 我们是大学里，好像没有做质检的啊。

T: 连质检都没有还搞什么产业化啊，想搞产业化就正儿八经来，要么跟生产企业合作，搞委托加工。

就算没有正儿八经的质检，起码一批单抗生产岀来要小试下吧，要不然直接批量生产，万一有问题损失岂不是很大。

0 一般委托加工他们可以给大量生产腹水吗，我们提供杂交瘤细胞株。

T: 干嘛不在高校做完这部分呢，花的是国家的钱，用的是免费劳动力。

把单抗做好，然后委托企业做成品，岂不是更好。

0 您的意思就是我们自己大量生产岀腹水，然后委托企业吗？T: 干脆把纯化也做了呗，提供纯化好的单抗给企业。

企业会对入厂的原材料进行检验的。

0 那如果我们纯化好了之后，那么多，企业一检查原材料不行，我们也白做了呀。

T: 不行，那肯定是白做了啊。

1.关键是你抗体制备的工艺要过关，每次制备的批间差异大的话，说明单抗制备工艺不成熟，需要优化。

问: 新手请教个问题，验证的ELISA 抗体对可以直接用于胶体金研发吗？只要通过调整浓度配比即可？还是需要重新寻找、检测抗体对？T: 这个不好说，ELISA 能用的，胶体金不一定能用，先做做试试吧，不行再换。

0 这个周期长吗？T: 看实验技能，如果准备工作做好的话，一天以内。

0 抗体对反应，ELISA 和胶体金，除了载体不一样，还有很多差别吗？我开始觉得可以直接拿过来用呢。

T :差别很多很多很多很多，位阻亚型纯度••…都是区别。

大部分都可以的。

0 正常情况下，产品研发周期要多久？1.顺利的俩月足够，不顺利的两年都不够。

T: 举个例子:比如说一个常规项目，原料成熟；质控品容易获得；标准无国标无行标，自己定标准；那么一整套工艺调试流程走下来，再做点性能评估试验，三个月吧。

不考虑稳定性测试。

如果是个科研课题的话，两个月足够了。

0 我现在就是有个ELISA 的盒子，有现成的抗体对，想用胶体金的方法实现检测，看看这种可能性。

T: 可能性很大。

2.酶免能用的原料，80% 在胶体金项目上会失败。

T: 九天这个说的有点绝对了吧。

3.不算绝对，这个比例已经比较乐观了。

大部分问题就岀现在，活性不够上，酶免可以通过加大浓度提升活性，可是胶体金实验的活性提升范围很小。

而且，涉及到前带问题，更是不好解决。

T: 我这80% 都能成功。

问: 我最近做胶体金，用标记好的金标抗体检测抗原，不识别，好着急啊。

1.不要喷到垫上，直接用标记好的抗体进行爬样，看看有无显色。

0 我标记的抗体，然后把抗原用枪点在了膜上，之后又加的金标抗体，发现没反应。

我是自己制备的抗体，而且实验条件相对于公司来说比较不正规，一个人摸索。

我只是想拿包被的抗原检测一下标记的抗体怎么样，看有没有标记上。

按理说，抗原应该能和标记后的抗体结合上，可是我标记后的抗体不结合。

2.包被了抗原，干燥完全了吗？没干燥，抗原就没固定在膜上，结合了也冲掉了啊。

0我加金标抗体后发现点过抗原的地方明显显白色，而周围的抹上会留下胶体金的红色痕迹。

这应该能说明并不是抗原被冲走的缘故吧。

大家被标记的蛋白是怎么处理的？3.亲水性不好，处理液改一下，多加点亲水的物质啊。

抗体是老鼠还是兔子产的。

0老鼠。

4.最佳PH定过了？0定了，最佳蛋白标记浓度也实验过。

标记完后胶体金的颜色有些变化，变紫了点，这种现象正常吗？T :颜色稍微有些加深是正常的，抗原抗体在免疫层析条件下，没有特异性反应，想找到原因是个大工程，特别是你现在的情况。

你的抗原是重组的吧？分子量有多大，纯度多少，保存液是什么，浓度多大。

是包涵体抗原吗。

0抗原是购买的，具体信息不是特别清楚，但是我用抗原包板子后做酶联免疫反应，是阳性的，这说明我的抗体是可以和抗原结合的。

保存液是PBS —1%BSA溶液。

T :这就是问题所在，ELISA做着效果好，胶体金不一定能用。

你的单抗是怎么制备的，是用这个抗原免疫的吗。

既然很多信息都不知道，给你提供一个思路，你标记抗原，然后包被抗体吧。

当然这两种方法都不太科学，不过对于高校来讲，就做个实验而已，也就够用了。

0免疫抗原和检测抗原都是一种，用抗原免疫小鼠，培养的杂交瘤细胞，收集细胞培养上清，然后纯化的上清。

保存液是PBS —1%BSA 溶液，有问题吗。

5.如果你直接拿这个划膜的话，肯定是不行的。

T :有问题。

不知道你为什么选择这个保存液，也许是供应商提供的。

反正不管怎样，你标记抗原，包被抗体, 效果可能会好点。

II 0不是，是自己用的，你的保存液用的什么啊。

T :直接用0.01M PB 7.4 稀释下就可以了。

问：微生物检测阴性时正常，没有死金现象，但是检测阳性菌株时有死金现象, 法。

造成死金现象的原因是什么呢？我调了样品垫T线变浅。

用的是双抗体夹心，换过几种缓冲液, pH都调过。

还是没有解决这个问题。

1.阳性菌株ph多大？阴性的ph ?垫子的0 NC膜底部停留了。

pH测过，有点酸，在■■多少?阴性pH没测，用的生理盐水或培养基。

垫子5 —6左右。

像这样，上面阳性，下面阴性。

ph开始用7.0，后来调过7.5、8.5，没用。

T :我给你看个图，看看眼熟不？上阳下阴（又说下面是调整之后的阳性）0你这个金完全死了。