实验路线及安排：项目主要在晋西北地区展开区域化试验，供试品种4个，均为当年生扦插苗,每个品种15株，采用完全随机区组设计进行，其中包括4个处理，3个重复。

所测定内容包括12项生理指标在相应部位(根、茎、叶)的年变化规律，并从形态、生理和生物化学方面对其抗寒抗旱性机理进行研究探讨。

在每个小区分别选健康植株2株，每株取其中上部位叶片1-2片，组成混合样，编号,带回实验室用一部分样品进行抗旱指标测定,其余样品放入冰箱低温处理，处理温度为0℃、-10℃，-20℃，然后进行抗寒指标测定,每月采样一次。

根的取样方法为每个小区分别选健康植株10株，挖出其部分根系组成混合样,处理方法同叶片；茎的取样方法为选健康植株10株，取其上部嫩茎组成混合样，处理方法同上。

2009年10月-2010年3月对所选材料进行人工低温干旱处理,完成相关实验指标的测定工作。

低温处理通过相对电导率及相关指标评价其抗寒性；干旱处理是通过对所栽品种进行适宜土壤水分、中度干旱、严重干旱条件的人为处理，测定杨树的蒸腾速率和相应指标，评价其抗旱性。

实验方法一．光合效率、气孔导度、蒸腾速率三项指标用光合仪直接测定；二．水势（小液流法）1.取10个干净的试管，分成A组和B组，都贴上0.05mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L 6个不同浓度标签，并向这两组试管中分别移取相应浓度的CaCl2溶液4mL。

2.取待测叶子数片，用打孔器在其上均匀打孔，混匀，将其分别装入A组试管（每支试管装10片），摇匀，滴入一滴相同浓度的甲烯蓝溶液，再摇匀。

3.用干净的毛细移液管，吸取1～2滴蓝色溶液，小心的插入装着相同浓度的B组试管中部，轻轻的挤出一滴蓝色溶液，观察蓝色液滴流动方向。

按下公式计算植物组织水势：Ψ=-iRTC式中：Ψ为植物组织水势（MPa）；C为CaCl2溶液的摩尔浓度（mol/L）；R为摩尔气体常数，0.008314MPa·L/mol·K；T为热力学温度（K），即273+t(t为当时摄氏温度)；I解离常数（CaCl2=2.6）三．叶绿素含量（直接浸提法）80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。

称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。

按下列公式计算样品中叶绿素含量。

CA =12.72A663-2.59A645(1)CB =22.88A645-4.67A663(2)CT =CA+CB=A652×1000/34.5 (3)在652nm时可一次测出叶绿素总含量mg/g FW）=(CVT/FW×1000)n (4)以上公式中，CA 、CB、CA+B分别为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的浓度（mg/L）；FW为鲜重(g)；C：叶绿体色素的浓度；VT为提取液总体积(mL)；n为稀释倍数。

四．丙二醛（MDA）含量测定试剂：20%三氯乙酸（TCA）溶液：20g三氯乙酸，加水80ml溶解；0．1%的TCA溶液：取250ul20%TCA稀释至50ml；0.5%硫代巴比妥酸溶液：0．25g硫代巴比妥酸溶解于50ml20%的TCA中。

1．取植株上一定叶位的叶片，剪成小段，混匀,称取0.3g；2．放入冰浴的砚钵中，加少许石英砂和2ml0.05mol/LPH为7.8的磷酸缓冲液，研磨成匀浆。

将匀浆转移到试管中，再用2-3 ml0.05mol/L磷酸缓冲液分两次冲洗，合并提取液；3．在提取液中加入5 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀；4．将试管放入沸水中煮沸10分钟（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），到时间后立即将试管取出并放入冷水浴中；5．带试管内溶液冷却后，3000g离心15min，取上清液并量其体积。

以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白测532nm、600nm、450nm处的吸光度；6.结果计算:MDA（mmol.g-1FW）=〔6.452*（A652-A600）-0.559*A450〕*Vt/Vs*FW式中，Vt:提取液总体积（ml），Vs：测定用提取液体积（ml），FW：样品鲜重（g）五．SOD酶活性的测定1、NBT反应液的制备（a）配置50mmol/l pH=7.8磷酸缓冲液：A：取NaHPO4·12H2O 8.95g定容于500ml；B：取KH2PO4 3.4g定容于500ml；（A：B=9：1）（b）13mmol/l甲硫氨酸：在180ml50mmol/l pH=7.8磷酸缓冲液中加入348mg甲硫氨酸，待完全溶解后加入后面的试剂。

（c）63umol/l硝基四唑蓝（NBT）：在180ml溶液（b）中加入8.4mgNBT；（d）1．3umol/l核黄素：在（c）中加入1.2ml核黄素母液（0．14g/30ml：0．14g 核黄素加入30ml水中）；（e）0.1mmol/lEDTA：在（d）中加入6.6mgEDTA。

将上述步骤配置的NBT反应液避光保存。

2、活性测定(1)酶液提取:同过氧化物酶液的提取(2)超氧化物歧化酶活性的测定:取6mlNBT反应液，加入50ul酶液混合均匀，将试管放于荧光灯架上，光强3000lx 照光10min，到时间后关灯，在722分光光度计560nm处测吸光度值，以内装NBT反应液的试管进行光照的作为对照，以内装NBT反应液但置于暗处的作为参比。

(3)超氧化物歧化酶酶活计算：酶活性= ()Ack A VAck W VtE-⨯⨯⨯⨯12Ack：照光对照管在560nm处的吸光度值Ae：样品管的吸光度值V：酶提取液总体积Vt：测定时所用的酶液体积W：提取酶液的材料鲜重六．PPO酶活性测定用尔茶酚法。

酶液提取过程同POD的方法。

反应体系：于10毫升试管中加入3.9毫升磷酸缓冲液（PH=6）和0.1ml酶待测液混合均匀，在30℃条件下放 1min，立即加1ml 0.1mol/L儿茶酚反应介质摇匀，用721分光光度计在λ=420 处测吸光度值变化。

放好后立即读数并记录，60s读一次，共读5次。

多酚氧化酶的活性按下式计算：活性（u/g）=ΔA*D/(0.01W*t)以每分钟吸光值改变0.01为一个多酚氧化酶单位。

ΔA---反应时间内吸光值的变化；W----鲜样品的质量（g）t----反应时间(min)；D----总酶液为反应系统内酶液的倍数七．POD酶活性的测定（用愈创木酚法）0.05mol/l愈创木酚：用烧杯称取6.207g愈创木酚，用少许酒精溶解，然后定容至1000ml。

（按需求不同照比例增缩）； 2%H2O2：取30% H2O267ml，加水至1000ml；(1)酶液提取分别称取各待测样品0.500克，加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.25克及少量石英沙和5ml磷酸缓冲液（pH=6）冰浴下充分研磨成匀浆，放入离心管，在10000r/min条件下冷冻离心10min，取上清液为酶提取液。

(2)过氧化物酶活性的测定取10ml试管，一只加入：2.9ml0.05M pH=6的磷酸缓冲液 + 1ml 0.05M的愈创木酚 + 1ml酶液，立即在37℃水浴条件下保温3min，然后加入1ml2%的H2O2继续保温1min，取出立即用721型分光光度计于波长470nm 处测定吸光度值变化，每隔60s 读一次数，共读五次。

以每克鲜重材料每分钟吸光度变化值表示酶活性大小(其计算公式同PPO)。

空白对照不加H2O 2八、脯氨酸含量测定1、原理:当植物缺水时体内的脯氨酸含量增加。

植株体内脯氨酸含量在—定程度上反映了植株体内的水分情况，因而可以作为植物缺水情况的参考性生理指标。

用人造沸石在 pH 1～7 范围内振荡溶液，可除去干扰的氨基酸或使不与茚三酮反应（如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等），脯氨酸与茚三酮试剂呈显色反应，其含量与颜色深浅成正相关，可用分光光度计测定。

此法有专一性。

2、试剂与仪器设备·茚三酮试剂：将 2.50 g 茚三酮于 60 mL 冰醋酸和 40 mL 6 mol/L 磷酸中，加热（ 70 ℃）溶解。

试剂至少在 24 小时内稳定。

．脯氨酸标准液：准确称取 25 mg 脯氨酸溶于少量 80 % 乙醇中，再用蒸馏水定容至 250 mL ，其浓度为 100 μg/mL 。

再取此液 10 mL ，用蒸馏水稀释至 100 mL ，即成 10 μg/mL 的脯氨酸标准液。

分光光度计，水浴锅，移液管，容量瓶，冰醋酸，仪器药品，离心机，烧杯，研钵，试管，恒温水浴3.实验步骤1、绘制标准曲线分别吸取脯氨酸标准母液 0 、 0.2 、 0.4 、 0.8 、 1.2 、1.6 、 2.0 mL放入 7 支具塞刻度试管，分别加入蒸馏水至 2.0 mL, 其脯氨酸含量分别为 0 、 2.0 、 4.0 、 8.0 、 12.0 、 16.0 、 20.0 μg 。

分别吸取上述标准溶液 2 mL ，加冰醋酸 2 mL, 茚三酮试剂 2 mL 加入试管中，混匀后加玻璃球塞，在沸水浴中加热 15 min 。

用分光光度计于波长 515 nm 下进行比色测定，以零浓度为空白对照。

将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作标准曲线。

2. 植株样品液的提取选取植株功能叶片 2 g ，用 3 mL 80 % 乙醇研磨（放少许石英砂）成浆状。

用 80 % 乙醇洗研钵，将提取物和洗液置于试管中。

80 % 乙醇总量为 10 mL 。

加盖置于黑暗中室温下提取 24 h ，或 80 ℃恒温水浴中提取 20 min 。

将提取液在放有活性炭的滤纸上进行过滤，重复过滤一次，除去色素和残渣。

将滤液置于试管中，加其重量 1/5 的人造沸石强烈振荡 5 min 。

将上层液在离心机上离心 10 min ，上清液备用。

3. 样品溶液的测定取 2 mL 上清液置于试管中，再加入 2 mL 冰醋酸和 2 mL 茚三酮试剂，加盖密封，在沸水浴上加热 15 min 。

用 3 mL 80% 乙醇代替样品液作为对照。

在分光光度计上测 515 nm 处各样品的吸光度，从标准曲线上求出样品溶液中脯氨酸含量。

4、结果计算样品中脯氨酸含量的计算：脯氨酸含量（μg/g ） = C* V T*100%/ W* V 1*106式中：C ——由标准曲线上查得的脯氨酸的质量，μg。

V T ——提取液总体积， mL 。

V 1 ——测定液体积， mL 。

W ——样品质量， g 。

0.5ml酶液（对照用0.5ml 80％乙醇代替）（做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml 显色液―――混匀，沸水浴15min，冷却后测OD520。