植物生理指标
1、植物酶液提取：
1)PVPP(固体,PVP单体与金属元素结合) 酚类吸附剂，酚的羟基与蛋白质
的羰基形成氢键，醌导致蛋白质聚合。

或polyclarAT（Polyclar-AT is insoluble PVP, also called as PVPP (PolyVinyl PolyPyrrolidine).
It binds phenols etc more efficiently than PVP and is easily
removable by filtration or a low speed spin）去除酚的毒害防止醌
颜色干扰。

PVP的肽键中的氧与酚羟基上的质子牢固结合，防止酚与酶
中肽键结合，保护了酶。

2)母液制备：0.1mol/L二硫苏糖醇DTT: 100mg至微量离心管，+650ul 水
0.5mo/L EDTA : 93gEDTANa,10g NaOH,定容到500ml
10mg/ml BSA：100mgBSA于9.5ml 水中
2、可溶性总糖测定（蒽酮比色法）
（1）原理：糖+硫酸—糠醛，其与蒽酮形成绿色络合物，620nm下显色。

本实验采用浓硫酸，倒入水中产生大量热，促进反应发生。

（2）标准曲线绘制：取略大于0.01g的葡萄糖，105度烘干至恒重，取0.01g 定容至100ml，配成100ug/ml的溶液。

取200mg蒽酮，溶于100ml 浓硫酸，冷却，保存于棕色瓶。

（注意：不需定容，量取100ml硫酸倒入烧杯即可，定容混匀时产气热溅出。

注意硫酸中是否存在杂质。

蒽酮非常敏感，不能用勺等挖取，只能直接倒，否则就会污染。

溶液配后呈亮黄色，放置
620nm.
实验结果：实际上并不理想，因abs均偏低，可试将标糖浓度适当升高。

葡萄糖含量ug 20 40 60 80 100
abs 0.09 0.169 0.259 0.332 0.427
3、电导率（DDS-11A）
1)接通电源前观
否指零，若有偏
差调节表头下
方凹孔，使其恰
指零。

2)接通电源，仪器预热10分钟。

3)将电极浸入去离子水中，须确保极片浸没，校正零。

4)根据数值选择量程，我选10ms
5)常数设为1
4、培养液PH测定(PHS-3C)
1)PH计在不使用时需使用KCL浸泡液浸泡，用枪从上小孔和帽注满，至
少浸泡24h。

将PH4.0缓冲剂包定容至250ml,再加入56g分析纯KCL，
加热溶解。

2)仪器使用前至少预热30min.
3)首先进行定位调节、斜率调节：将测量头用蒸馏水洗后，根据所测溶液
性质不同，放入不同溶液，待示数平衡，再分别调节定位、斜率至
6.86,4.00.
5、细胞活力测定（TTC法）
1)《植物生理学通讯》TTC法测定红豆杉细胞活力刘华[1] 梅兴园[2][1]湖北
省卫生职工医学院生物教研室，湖北荆州434000 [2]华中理工大学生命科学与技术学院，武汉430074）
2)药品配置：0.4%(m/v)TTC红四氮唑溶液：0.2gTTC, 加1.5ml 95%乙醇溶解，
用蒸馏水定容至50ml。

随配随用，不宜久藏，遮光，变红不可用。

3)原理：TTC氧化态为无色，被呼吸作用产生的H还原成红色的三苯基甲
4)步骤：10ml试管：2.5ml 0.4% TTC+2.5ml PH7.0 0.1mol/L PBS+0.2g鲜细胞,25
度避光13-16h,倒掉液体，以蒸馏水洗细胞三次，加5ml 95%乙醇使细胞完全脱色，70度水浴20min,以乙醇为对照，测485nm处吸光度，此数值可直接作为细胞活力的衡量标准。

一般所得值1-2
6、可溶性蛋白含量测定（考马斯亮蓝G250染色）
1)原理：
2)溶液配置：
a)考马斯亮蓝溶液：100mg G250,溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%(w/v)的
磷酸，定容至1000ml。

于棕色瓶常温保存30天。

蓝黑色过滤后形成棕褐色稀释成淡蓝色；
b)50mmol/LPBS PBS直接稀释对PH无太大影响。

c)100ug/ml标准蛋白溶液：精确称取牛血清蛋白10mg,加水定容至100ml
3)步骤：
a)标准曲线绘制：6ml反应体系，盖盖摇匀程度均一，放置反应3分钟，
测595nm处吸光度。

比色在1h内完成。

b)样品测定：100ul 样品提取液
900ul 蒸馏水
5ml G250溶液
7、苯丙氨酸解氨酶PAL（陈建勋）
1)原理：PAL催化苯丙氨酸的脱氨反应，使氨释放形成反式肉桂酸，反式肉桂
酸在290nm处有重要吸收。

此酶在植物体内次生物质代谢如木质素等起重要作用。

2)药品配置：PH8.8 0.1mol/L 硼酸缓冲液
0.02mol/L L-苯丙氨酸：0.330g L-苯丙氨酸,上述缓冲液定容至100ml
3)步骤：1ml 0.02mol/L L-苯丙氨酸
2ml PH8.8 0.1mol/L 硼酸缓冲液
100ul 酶液（2份ck : 100ul 提取缓冲液）
混匀，290nm处测起始OD，精确计时，30度保温30分钟后，290nm处测吸光度。

以每30min 吸光度增加0.01所需酶量为1U.
4)计算：PAL活性（U/gFW）= 30min内OD差值*酶液总体积
0.1ml（酶液）*提取酶液时样品重*0.01
5）注意：
a)PAL为诱导酶，除光诱导外，切割受伤，病害感染等也能诱导此酶活性升高。

b)除直接用新鲜材料提取进行测定外，也可将诱导好的材料制成丙酮粉，然后
再提取测定。

8、过氧化氢酶CAT
德]B．施特尔马赫著．钱嘉渊译．酶的测定方法[M]．第1版．中国轻工业出版社，1992．p186-188
1)原理：CAT催化H2O2 分解，240nm处检测H2O2 减少量。

CAT以PH7.0，
37度时活性最高，冷冻，阳光，氧气降低酶活。

2)药品：0.18%H2O2 ：600ul 30% H2O2 用PH7.0 PBS稀释至100ml.现配。

（一般情况下，配置的双氧水冬天两周用完，夏天一周，避光）
25度预热的蒸馏水
3)步骤：
a)为检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低，以蒸馏水为参比，用移液
管将1.0ml底物溶液和1.9ml蒸馏水滴入一只1厘米比色皿，并调水温
至25℃。

在连续5分钟内240nm处测定吸光度，若吸光度的降低幅度超
过0.01，则在计算主值时须减去此值。

b)以蒸馏水为对照，实验组：1ml0.18%H2O2 +1.9ml蒸馏水+100ul酶液，在
连续5分钟内240nm处测定吸光度。

（每隔1分钟读取一次结果，直至
每分钟吸光度的降低值达到稳定为止）
c)计算：在上述条件下，每分钟酶促分解1umol过氧化氢的酶量定为1个
酶活力单位。

×3 ／0.0436×Ew
U/mg = E
240
式中：E240—240nm处每分钟内吸光度的降低值
Ew—每0.10ml所用酶液中含酶的重量（mg）
0.0436—240nm处1umol过氧化氢的吸光度
3—反应混合液的总体积。

4)注意：酶液浓度应为5-20u/ml
8、超氧化物歧化酶SOD（NBT光还原法陈建勋）
1)原理：NBT在Met和核黄素存在下，照光后发生光化还原反应生成蓝色甲
腙，蓝色甲腙在560nm处有最大光吸收。

SOD能够抑制这个还原反应，抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。

2)药品配制：
a)50mmol/L PH7.8 PBS
b)220mmol/L Met: 3.2824g Met,用50mmol/L PH7.8 PBS溶解定容至100ml.
现配现用，于4度冰箱保存1-2d.
c) 1.25mmol/L NBT（氯化硝基四氮唑兰）溶液：避光现配，0.102gNBT,用
50mmol/L PH7.8 PBS溶解定容至100ml. 于4度冰箱保存2-3d.
d)0.033mmol/L核黄素：2.52mg核黄素，用50mmol/L PH7.8 PBS溶解定容
至200ml于棕色瓶，4度冰箱保存8-10d.
3）步骤：反应总体积5ml ,两个光对照，两个暗对照
比色时终浓度每个管中：50mmol/L PH7.8 PBS 4.05ml
220mmol/L Met 300ul 13mmol/L
1.25mmol/L NBT 300ul 75umol/L
0.033mmol/L核黄素300ul 2umol/L
酶液50ul 对照以缓冲液混匀后，光对照与样品均置于4000lx日光灯（我置于3根2000lx）反应20min,保证受光一致！否则严重影响结果。

以暗对照为参比，检测560nm处吸光度。

4）计算：以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位。

SOD总活性(u/gFW)= （光对照吸光值—样品吸收值）*酶液总体积
光对照吸光值*0.5*样品重*样液体积（此处为50ul）SOD比活力（u/mg Pro）= SOD总活性
蛋白质浓度
5）加入酶量以抑制反应的50%为最佳？。