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生理指标测定

生理指标测定_16种1、冻害指数——3~5株观察形态【4种常绿水生鸢尾抗寒性的初步研究】张京,2012李刚,姜卫兵,翁忙玲,等.木兰科6种常绿树幼苗抗寒性的初步研究[J].园艺学报,2007,34(3):783-786.描述叶色变化:在最冷月( 2月中旬) , 所有供试树种均有不同程度的冻害表现, 乐东拟单性木兰受冻害最轻,只有部分植株的少量叶片有些许水渍状, 大部分植株完好无损, 冻害指数为041, 基本不受冻害;阔瓣含笑也长势良好, 有少部分叶片出现褐色水渍状, 冻害指数为14, 受轻度冻害; 金叶含笑受到了中度水平的冻害, 部分植株的叶片整个叶面呈现红褐色水渍状, 冻害指数为25; 红花木莲、醉香含笑和观光木受到了重度冻害, 大多数植株的部分叶片呈焦黄、褐色脱落, 有的整个植株呈萎蔫状,长势非常差, 冻害指数分别为3.2、3.9、4.3.2、相对含水量叶片相对含水量采用饱和称重法[21]测定。

选取各处理部位一致、成熟完好的叶片迅速称其鲜重,再用蒸馏水浸泡8~24 h,使组织吸水达到饱和状态,取出后吸去表面水后立即称其饱和重,然后在105 ℃下杀青30min,在80 ℃下烘干至恒重(1h~24h),放在干燥器中冷却,称其烘干重。

根据公式计算:LRWC( %) = [ (鲜重-干重) /(饱和重-干重) ] × 100%3、光合参数(光合仪测定)光合速率、CO2浓度、光合有效辐射、叶绿素或用95%乙醇浸泡法,浸泡4~5d,测定叶绿素。

《植物生理生化实验原理和技术》4、膜质过氧化:相对电导率(略)、MDAMDA(丙二醛)的测定试剂:三氯乙酸10% (TCA 溶液):称取100g溶于1L 蒸馏水中;0.6%硫代巴比妥酸溶液(6%TBA):1.8g溶于300ml TCA 溶液中(加热溶解)称取植物叶片0.3克, 先加入2ml TCA和少量石英砂研磨至匀浆,再加入4ml 10%三氯乙酸(TCA)进一步研磨(总体积为6ml),然后以4000g离心10min, 取上清液待测。

吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水),加入2ml 0.6% TBA,混匀物于沸水浴上反应15分钟,迅速冷却后再离心(在冰箱中冷却较快)。

取上清液测定在532,600和450nm波长下比色。

公式CMDA(nmol L-1)=[(A532-A600)-0.0571×(A450-A600)]/0.155计算MDA量(排除多糖干扰),用每克干(鲜)重中MDA的量表示MDA的含量,单位μmol g-1干(鲜)重或nmol g-1干(鲜)重。

1、含量计算双组分光光度计法:已知蔗糖与TBA反应产物在450nm和532nm波长下的比吸系数分别为85.40,7.40;MDA与 TBA显色反应产物在450nm波长下无吸收,其吸收系数为0,532nm下比吸收系数为155,根据双组分光光度计法建立方程组,计算公式如下:C1(mmol/L)=11.71 D450C2=[6.45(D532—D600) — 0.56 D450]X提取液总体积/测定时用的提取液体积*样品鲜重C1:可溶性糖的浓度, C2为MDA的浓度, D450D532D600分别代表450,532,600nm下的消光度值.参:Brege J G.Microsomal lipid peroxiodation. Methods in Ezymmology.1978,52:302-306 J.G. Buege and S.D. Aust, Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol.52(1978), pp. 302–306.注: 沸水浴时,可使用小试管,然后上部用保鲜膜包扎.(如橡皮筋)附4.1 MDA、可溶糖含量—硫代巴比妥酸加热显色法【原理】植物遭遇逆境胁迫或衰老过程中,由于自由基、活性氧的积累引起膜脂过氧化,产生脂质自由基,进一步诱发膜脂连续过氧化并导致蛋白质交联变性,而引起细胞损伤或死亡。

MDA 是膜脂过氧化的最终产物,通过其含量的测定可了解膜脂氧化伤害的程度,比较不同植物抗逆性的差异。

在酸性和高温条件下,MDA可与硫代巴比妥酸(TBA)反应,生成红棕色的产物三甲川(3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮)。

该产物在532nm处有最大吸收峰,测定反应产物在532nm处的光密度值,可计算出MDA含量。

但植物组织中的可溶性糖亦与TBA产生颜色反应,其产物对532nm 光的吸收干扰测定。

采用双组分光光度法及其计算式,可排除干扰,计算出MDA的含量。

【器材】分光光度计离心机水浴锅研钵剪刀试管【试剂】(1)10%(W/V )三氯乙酸(TCA ):称取10gTCA 定溶于100ml 水中(2)0.6%硫代巴比妥酸(TBA ,以10%的TCA 配制):取0.6035g 溶于100ml 上述TCA 中(适当加热,否则难溶) 【方法】(1)取0.1g (取0.25g 或0.3g )叶片,加10%TCA10ml (8ml )研磨,研磨后在4000r/min 下离心10min (15min ),上清液为样品提取液(2)取上清液2ml (对照加2ml 蒸馏水),加0.6%的TBA2ml ,混合后在100℃水浴上煮沸10min (15min )(以小试管冒小气泡开始计时),迅速冷却后如有沉淀再离心一次。

分别测定上清液在450nm ,532nm ,600nm 处的吸光值。

【计算】MDA 浓度(umol/L )=6.45(A 532-A 600)-0.56A 450 MDA 含量(umol/gFW )=MDA 浓度*VT*10-3/FW 可溶糖浓度(umol/L )=11.71A 450可溶糖含量(umol/gFW )=可溶糖浓度*VT*10-3/FW VT ——提取液总体积(ml ) FW ——样品鲜重(g )【注意】低浓度的铁离子能够显著增加TBA 与蔗糖或MDA 显色反应物在532、450nm 处的吸光值,所以在蔗糖、MDA 、TBA 显色反应中需一定量的铁离子,通常每克干重植物组织中铁离子的含量为100-300ug ,根据植物样品量和提取液的体积,加入Fe 3+的终浓度为0.5umol/L附4.2 过氧化氢(MDA 和过氧化氢用同一提取液)参考Matsubara 等(1983),Partterson 等(1984),林植芳(1988)和刘俊等(2000)的方法,利用H 2O 2与和钛离子形成有色的[TiO (H 2O 2)]2+配合离子(特异吸收峰在410 nm )的原理对H 2O 2含量进行测定。

【药品】10%三氯乙酸:称10g 三氯乙酸定容至100ml20%TiCl 4浓HCl 液:吸取2ml TiCl 4,用10ml 浓HCl 溶解(注意:两者皆为强挥发性强腐蚀性液体,务必轻拿轻放,通风橱中进行,注意避光保存) 1mol/L 硫酸:吸取5.4ml 浓硫酸,稀释至100ml1mmol/L 过氧化氢1000ml :取0.15ml30%过氧化氢,定容至1000ml 【方法】准确称取0.5 g (最佳)不同人工老化大豆的新鲜胚轴于6 mL 10%三氯乙酸中研磨成匀浆,定容至10 mL (就用8ml 研磨)。

提取液在10000×g 室温下离心10 min 。

取上清液1 mL 加入0.1 mL 20%TiCl 4的浓盐酸液,再加入0.2 mL 浓氨水。

4500×g ,室温下离心10 min 。

沉淀用3mL 1 mol L -1硫酸充分溶解后,置紫外可见分光光度计上测定410 nm 处吸光光度值。

用标准过氧化氢溶液(0-1mmol L -1)用以上方法做标准曲线。

根据样品吸光光度值对应标准曲线求出过氧化氢量,并计算过氧化氢含量,单位μmol min -1 g -1干重( or 鲜重)。

5、游离脯氨酸【原理】当用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性印三酮加热处理,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中。

色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低,在520nm波长下比色测定吸光度,从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

【器材】【药品】(1)80%乙醇(8ml乙醇加2ml水),人造沸石,活性炭(2)6mol/L磷酸:取纯的磷酸40.92ml,用100ml容量瓶定容。

(3)茚三酮试剂:将1.25g茚三酮(重结晶)于30ml冰醋酸和20ml 6mol/L的磷酸中加热(70℃)溶解。

4℃保存,试剂两天内稳定,但最好现配现用。

茚三酮的用量与脯氨酸的含量有关,一般当脯氨酸含量在10μg/ml以下时,显色液中茚三酮的浓度要达到10mg/ml,才能保证脯氨酸充分显色。

(4)脯氨酸标准液:准确称取10mgPRO溶于少量80%乙醇中(也可直接用蒸馏水溶),定容到100ml,其浓度为100μg/ml。

(再取此液10ml,用蒸馏水稀释至100ml,即成10μg/ml的脯氨酸标液——一般不做此步)【方法】(制样和标准曲线一起做)(1)绘制标准曲线吸取脯氨酸母液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0ml分别放入8个50ml容量瓶中,分别加入蒸馏水定容,配成1ug/ml,2,3,4,5,6,7,8μg/ml。

分别吸取上述标准溶液2ml,加冰醋酸2ml,茚三酮试剂2ml入试管中,混匀后加玻璃球塞,在沸水浴中加热30min。

冷却后准确加入4Ml甲苯,剧烈震荡30S,静置10min,待红色物质全部转入甲苯溶液时,用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中,用分光光度计在520nm下进行比色测定,以甲苯溶液为空白对照,以脯氨酸浓度(或含量)为横坐标,以吸光度为纵坐标作标准曲线。

(2)样品液提取取叶片0.1g(0.3g为宜)加5ml3%磺基水杨酸,加盖(有塞试管),在沸水浴中提取10min,提取过程中要经常摇动,冷却后,以3000r/min离心10min,上清液待测。

取2ml待测液于另一干净的带玻塞试管,加入2ml冰乙酸,2ml酸性茚三酮,在沸水浴中加热30min,溶液即成红色。

冷却后加入4ml甲苯,摇荡30S,静置片刻,用吸管轻轻吸取上层红色脯氨酸甲苯溶液于比色杯中,以甲苯为空白对照,比色【计算】脯氨酸含量=浓度*提取液体积*2.5/(样品干重*106)【注意】配制的茚三酮溶液仅在24h内稳定,因此最好现配现用。

茚三酮的用量与脯氨酸的含量相关。

一般当脯氨酸的质量浓度在10ug/ml时,显色液中茚三酮的质量浓度要达到10mg/ml时才能保证充分显色称量可以大些,且称量基本一致6、POD、CAT、SOD、可溶性蛋白POD,CAT, SOD,可溶性蛋白含量用同一提取液。

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