生物药物分析与检验
生物药物分析与检验的特点：
1.需要进行相对分子质量的测定、
2.需要检查生物活性
3.需做安全性检查
4.需做效价测定
5.要用生化法确证结构
终点测定法的条件：
1.必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品；
2.能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件；
3.反应中底物的减少、产物的增加、辅酶物质的改变等可以借助简便的方法进行测定
高效液相色谱法的定性分析
1.利用已知物质定性的方法
①利用保留特性
②利用不同柱比较
2.色谱法与其他方法结合定性
①利用化学反应定性
②利用选择性检测器定性
③液相色谱-质谱联用技术、液相色谱-核磁共振联用技术
生物检定的范围:
1.药物的效价测定
2.体内微量生物活性物质的测定
3.中药质量的控制
4.某些有害杂质的限度检查
基因工程药物的特点：
1.分泌量极低而生理、药理活性极高
2.具有细胞和组织特异性
3.多数细胞生长因子具有多功能性
4.细胞因子间存在复杂的相互作用
5.具有低免疫原性
特殊杂质检查方法：物理化学区分方法
一、物理法“1. 臭味及挥发性的差异
2. 颜色上的差异
3. 溶解行为上的差异
二、化学分析法
1. 酸碱反应
2. 呈色或沉淀反应
3. 产生气体
4.氧化还原反应
免疫电泳技术：将琼脂电泳与免疫扩散结合起来，即利用电场作用下带电蛋白质在琼脂凝胶中具有不同的迁移率，以及相同的蛋白质具有完整的抗原性的特点，用于分析抗原或抗体性质的一种技术。
电泳：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。
终点测定法：先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的偶数酶反应）使被测物质定量地进行转变，然后在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量
生物检定：利用生物体（整体动物、离体组织/器官、细胞和微生物等）的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。
质反应：当一定剂量的药物注入动物体内后，观察某一反应或反应的某一程度出现与否，只有质的变化。
量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者。
杂志：指药物中存在的无治疗作用、或影响药物稳定性和疗效、甚至对人体健康有害的物质
药典主要包括凡例、正文、附录和索引四部分组成
生物药物常用的定量分析法：酶法、电泳法、免疫分析法、理化测定法、生物检定法
酶分析法包括酶法分析和酶活力测定
酶联免疫吸附分析法包括直接法和夹心法
电泳法分为自由界面电泳、区带电泳和高效毛细管电泳。
指示液：溴酚蓝用于指示电泳终点；甘油比重大，使样品下沉
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应：分子筛效应、浓缩效应、电荷效应
高效液相色谱法的优点：速度快、分辨率高、灵敏度高、柱子可反复使用、样品容易回收
要获得较好色谱分离有两个途径：一是最大峰间的距离要大，二是色谱峰要窄
常用的脱气方法：真空脱气法、煮沸脱气法、溶剂的滤过
微生物检定法测定抗生素效价：稀释法，浊度法，管碟法。
其中我国是管碟法。
氯化物检查法：用硝酸，硝酸银
硫酸盐检查法：用盐酸，氯化钡，标准对照液：标准硫酸钾溶液
铁盐检查法：中国药典和美国药典采用硫氰酸盐，英国药典采用巯基醋酸法
重金属检查常用的显色剂：硫代乙酰胺、硫化钠
澄清：不超过0.5号浊度标准液的浊度时；几乎澄清：介于0.5号至1号浊度标准液之间
胰岛素的含量测定：高效液相色谱法；
生物活性检查：生物测定法；
生物检定法：小鼠血糖法、小鼠惊厥法、家兔血糖法
氨基酸药物分析的含量测底
1.酸碱滴定法——谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸
2.非水溶液滴定法——甘氨酸、丝氨酸、亮氨酸、、、、、
3.定氮法——精氨酸和天冬酰胺
4.碘量法或溴量法——盐酸半胱氨酸、L-胱氨酸
5.HPLC或氨基酸自动分析仪：谷丙甘氨酸胶囊等复方制剂
蛋白质药物分析的含量测定
1.定氮法——人胎盘的蛋白质测定
2.电泳法——人血白蛋白的纯度测定
3.高效液相色谱法——胰岛素含量测定
4.生物检定法——硫酸鱼精蛋白的效价测定
葡萄糖酸钙中蔗糖或还原糖类检查用的试剂是碱性酒石酸铜试液
蔗糖加硫酸煮沸后，用氢氧化钠试液中和，再加亚硫酸钠试液，产生红色沉淀
葡萄糖中存在的特殊杂质为糊精
取乳糖5.0g，加热水25ml溶解，放冷，加硝酸汞试液5ml，5分钟内不得产生白色絮状沉淀，这是检查蛋白质类杂质
葡萄糖注射液的含量测定方法为旋光度法
用旋光度测定法测定葡萄糖氯化钠注射液时，加入氨试液的作用加速D—葡萄糖α和β两种互变异构体互变平衡的到达
葡萄糖的Fehling反应所需要的试剂是碱性酒石酸铜
Keller-Kiliani反应α-去氧糖的反应洋地黄毒苷、地高辛（靛蓝色）
Kedde反应不饱和内酯的反应去乙酰毛花苷（红紫色）
纸色谱地高辛
1、葡萄糖注射液的鉴别反应是Fehling反应
2、洋地黄毒苷的鉴别是Keller-Kiliani反应
3、去乙酰毛花苷的鉴别反应是Kedde反应
4、用于地高辛鉴别和特殊杂质检查的方法PC
特殊杂质检查
洋地黄毒苷洋地黄皂苷（灵敏度法）
地高辛洋地黄毒苷（PC）
脂类药物含量测定方法
1.酸碱滴定法——熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸，用氢氧化钠滴定液
2.重量法——谷固醇含量测定，加入洋地黄皂苷
3.紫外分光光度法——大豆磷脂中磷，比色法；胆红素，牛黄
4.气相色谱法——鱼油多不饱和酸
基因工程药物的指控要点和主要方法（论述）
1.1 原材料：主要是对目的基因、表达载体及宿主细胞（如细菌、酵母、哺乳细胞和昆虫细胞）的检查，以及使用它们时制订严格要求
1.2 培养过程
无论是发酵还是细胞生产，关键是保证基因的稳定性、一致性和不被污染。
主要控制的有生产用细胞库、有限代次的生产、连续培养过程。
1.3 纯化工艺过程
要求能保证去除微量DNA、糖类、残余宿主蛋白质、纯化过程带入的有害化学物质、致热原，或者将这类杂质减少至允许量。
1.4 最终产品
主要表现在生物学效价测定、蛋白质纯度检查、蛋白质的比活性、蛋白质的性质鉴定几个方面。
1.5 杂质检测
蛋白类，由于降解、聚合或者错误折叠而造成的目的蛋白变构体在体内往往会导致抗体的产生；非蛋白类，主要有细菌、病毒、热原质和DNA几种类型，往往在极低的水平就可以产生严重的危害作用。
1.6 安全性试验
其中的无菌试验、热原试验、安全性和毒性试验按我国新颁布的《中国生物制品规程》进行。
2.1 蛋白质含量
常用的方法有光吸收法、双缩脲法、福林-酚法等。
2.2 蛋白质纯度
是一个重要的指标。
常用的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、等电聚焦（IEF）、毛细管电泳（HPCE）、高效液相色谱（HPLC）等。
2.3 蛋白质的分子量测定
常用的方法有SDS-PAGE、HPCE、质谱法等。
2.4 蛋白质等电点的测定
理论上，一种蛋白质只有一个等电点。
常用的方法有等电聚焦法等。
2.5 氨基酸组成分析
常用的方法有水解蛋白质或多肽、氨基酸衍生方法（茚三酮法、荧光胺法）等
2.6 部分氨基酸序列分析
首先将氨基酸一个一个依次从蛋白质或者多肽的末端（N端或C端）切割下来，有化学法和酶法（化学法用得较多）；然后在氨基酸残基上衍生一个生色基团，通过HPLC法进行分离测定。
包括N端氨基酸分析和C端氨基酸分析。
2.7 肽图分析
根据蛋白质分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点，将蛋白质裂解成较小的片断，通过一定的分离检测手段形成特征性的指纹图谱来进行分析。
例：在同一根色谱柱上测出：正庚烷，正辛烷和未知物的调整保留时间分别为14.08s ，25.11s 和16.32s ，试计算它们的保留指数I 。
解：由定义可知：
I 庚=100×7=700 I 辛=100×8=800
由求出保留指数与文献保留指数对照可知未知物为甲苯。
杂志限量计算题
杂质限量%=杂志最大允许量/供试品量*100%
=标准溶液的体积*标准溶液的浓度/供试品量*100%]
即L=V*c/S*100%
例1：检查某药物中的砷盐，取标准
砷溶液2mL （每1mL 相当于1g 的As ）制备 标准砷斑，砷盐限量为0.0001％，应取供试品的量为 B
A. 0.20g
B. 2.0g C ．0.020g D. 1.0g E. 0.10g
检查维生素C 中的重金属时，
若取样量为1.0g ，要求含重金属不得过百万分之十，问应吸取标准铅溶液（每1ml ＝0.01mg 的Pb ）多少ml ？ D
A. 0.2ml
B. 0.4ml C ．2ml D. 1ml E. 20ml )lg lg lg lg (')(')(')(')(')(')(')(Z t t t t I t t t Z R Z R Z R X R X Z R X R Z R +--=>>++11100726)708.14lg 11.25lg 08.14lg 32.16lg (100)lg lg lg lg (100')(')1(')(')(=+--=+--=+Z t t t t I Z R Z R Z R X R X。