能够与臭氧反应产生化学发光的物质： 不饱和脂肪烃和芳香族化合物； 含有N，S等杂原子的化合物； 卤代有机酸和卤代烷烃； N的氧化物和CO； 金属有机化合物； 细菌。
3. 萤火虫发光 (firefly BL)
Luciferin + ATP + O2
max = 562 nm 此反应重要的分析对象是ATP 10-11~10-14mol
化学发光原理及其应用
主要内容
化学发光基本原理 化学发光分析方法 常见化学发光体系及其分析应用
Part I. 化学发光基本原理
一、化学发光原理：伴随化学反应的光发射现象
某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生 的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长 的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光 (chemiluminescence) 。 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中 ，称生物发光(bioluminescence)。
3 , 4 - Dihydroxybenzoic acid
+69
2. 气相 CL体系
Journal of Chromatography A, 842 (1999) 267–308
以N的氧化物为例 O3 + NO O2 + NO2* NO2* NO2 + hv ( = 600–2800 nm)
任何对此过程产生影响的物质浓度 都可能用化学发光法测定
二、化学发光分析法流路
1. 分立式进样化学发光仪
R1
R2 s
PMT
暗室
这类仪器适合于选择性好, 量子效率高或发光体寿命长的化学发光反 应的监测。
不适用于快速化学发光反应(<15S)的重现性监测。
2. 流动注射进样化学发光仪
试 剂 瓶
流通池(flow cell)
还原剂：氨基酸、SO2、碘、药物、毒品等具有还原性的物质
量子产率不高，可以加入强还原 性物质增强体系灵敏度
可以测定化学需氧量 Talanta 2003, 61, 651-658
六、其他化学发光体系
1. 高价铈 CL体系
Chemiluminescence of Ce (IV) and surfactant Tween 20
2 , 4 - Dihydroxybenzoic acid Phloroglucinol m-Nitrophenol Resorcinol p-Hydroxybenzoic acid
o-Nitrophenol Phenol Rutin Catechol
+557
+408 +326 +296 +276 +115 +96 +80 +73
多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用
林金明 Analytical Chemistry 2002
五、酸性高锰酸钾化学发光体系
1. KMnO4 – 还原剂 CL体系
KMnO4 + Red — Intermediate (激发态) — 直接CL Fluorophore Fluorophore (激发态) — 间接CL
催化剂: 过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Cu2+ 、Mn2+、Co2+、 V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+ etc.)
间接测定：在生物酶作用下与O2生成H2O2的葡萄糖和氨基酸以及相应
的酶
2. 邻菲罗林 (1,10-phenanthroline)
CHO CHO + H2O2 N N N N
发射波长：取决于共存荧光物质
F+. F*+ 2CO2
F*
F+
h
四、碱性高碘酸钾化学发光体系
化学发光原理－活性氧中间体型
ˉ IO4 + O2 + 2 OH ˉ O2ˉ + CO32 ˉ 4 O2ˉ + 4 H2O (O2)2* 2 CO3ˉ ˉ 2 O2 ˉ + IO3 + H2O CO3ˉ + O22 ˉ (1) (2) (3) (4) (5) (λ = 430 ~ 450 nm) (6)
Light intensity [NO]
Measurement of NO2
3NO2 + Mo (Catalyst) 450C 3NO + MoO3 (reduction)
Total NO (initial + reduced NO2) = NOx [NO2] = [NOx] – [NO]
臭氧法测定N的氧化物
luciferase
AMP + Oxyluciferin + hv
4. 细菌发光 (bacterial BL)
FMNH2 + O2 + RCHO
还原型吡 + H2O + hv
max = 490nm
主要分析物 FMN
10-12mol
此反应常用于NADH和NADPH试验 10-15mol
样品sample
PMT
recorder
waste 蠕 动 泵
暗室
几乎适用于所有 < 15s的快速化学发光反应
并且可以增加合适的延迟流路或采用停流技术以适应长寿命的 化学发光反应，所得的化学发光强度可以随时间积累
3. HPLC-CL联用技术
流动相A 流动相B 高压泵 混合器 高压泵 色 谱 柱 废液 DAD检测器 试剂1 混合器 试剂2 混合反应 流 动 池 光电倍增管 滤光片 记 录 进样阀
+ hv
氧化剂: H2O2
催化剂: Cu2+ Co2+ Pb2+
Fe3+ Ni2+
抑制剂: 蛋白质与Cu2+形成络合物
二、吖啶酯类化学发光体系
代表性物质：光泽精 (lucigenin)
CH3 N
+
CH3
Oxidation OH N+ CH3 .2NO3
-
N
NMA
*
O
+
LIGHT
N-METHYLACRIDONE (NMA)
化学发光光谱与发光体的荧光发射光谱具有对应关系
化学发光光谱中避免了激发光源的干扰
二、化学发光反应发生的条件
能量，通道，荧光物质
化学反应是放热反应。
化学反应的自由能的变化与发光波长的关系: –G h / ex 2.857 × 10 – 4 千卡 / ex 摩尔 400~750nm的可见光发射时所需要的G 的数值应在 38~71千卡(170～300 kJ/mol)之间。
荧光产生的原理
入射光(h1)激发下 的光发射现象
入射光 h1
荧光 h 2
磷光 h 3
化学发光包含化学反应、能量传递以及后续激发 态弛豫(与荧光一致)三个过程
化学发光的原理 化学反应释放的 能量(-G)使基态物 质被激发而产生的后 续光发射现象
化学 反应 - G 化学发光 h
2. 化学发光光谱
化学发光原理－能量传递型
O Ar O C O
O C O
O + 2 ArOH C O
2 CO2 + h1
C O
O C O
OAr + H2O2 O
(CO2)2*
C
氧化剂：H2O2
背景发光：max = 440 nm, 550nm
O +F C O . O C O F+.
O C O
O C O
O C O
.
O C O
max = 445 nm
Lucigenin
氧化剂：H2O2；还原剂 + O2 还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸
催化剂：过渡金属离子、酶 抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用 间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶
量子产率高，易于标记，是发 展化学发光免疫分析和DNA发 光探针的重要标记物
三、过氧化草酸酯(TCPO)类化学发光体系
暗室
将化学发光高灵敏度的特点与HPLC高分离效率的优势结合，可以 应用于复杂体系中多种痕量物质的定量分析，一般不需要复杂的衍 生过程
Part III. 常见化学发光体系及其 分析应用

鲁米诺化学发光体系 吖啶酯类化学发光体系 过氧化草酸酯类化学发光体系 无机物化学发光体系

灵敏度高，响应的物种数多，但是选择性差
Part II. 化学发光分析法
一、化学发光分析法原理
R+A B + h
dcA V = — = k[R][A] dt
使[R]过量 CA(t) = CA0 e-kt Icl(t) = cl V = cl kCA(t) = cl kCA0 e-k t 尽管A物质的 CA0 各不相同, 但 I 达到 Imax 的时间相同. e-k’t为常数. Icl(t) CA0 定量分析的依据
*
*
氧分子对的发射： 490 ~ 500 nm CO2双分子发射： 430 ~ 450 nm
nanogold
(O2)2* + 2 H2O2 + 4 OH ˉ (λ = 490 ~ 500 nm)
2 O2 + hν (CO2)2* + O22 ˉ 2 CO2 + hν
nanogold
(CO2)2*
→ DPA + h ν ( λ =
三、化学发光的表征 光谱：仅取决于体系的激发态 动力学曲线（反应时间）
化学发光强度
化学发光强度取决于发光过程的量子产率(cl)反应速率(dc/dt)