实验三、酶切与连接
一、实验目的与原理简介
限制性内切酶在基因工程中主要应用地以下两个方面：制作基因酶切图谱和进行基因克隆。

制作基因图谱，就是利用特定的酶切出特定的条带；
而利用基因克隆时选择酶应注意以下几个方面：
1）克隆片段的长度；2）克隆片段中切点的情况3）载体上切点的情况；
4）切割与连接方式；5）接头状态。

酶切方式可分为部分酶切和完全酶切两种：
1）部分酶是指同一DNA 片段上有些被切开而另一些未被切开，此法主要应用于基因 的克隆 。

用部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。

进行部分酶切可通过两个方式：一是不同的时间内在同一酶反应管中取样终止反应，利用时间来控制酶切的程度。

另一种是在其余条件相同时控制 酶的稀释度，利用不同酶浓度控制酶切程度，这种方法因易于控制反应而被广泛应用。

2）完全酶切法适用于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA 片段的分离工作。

完全酶切又可分为单酶切、多酶切两种。

在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同 的反应条件时，可同时进行酶切，不然须在前一种酶作用完成后将其失活，而后进行第二种酶切反应，这样可以避免片段混乱现象的出现。

二、材料和试剂
限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液 、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温水浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪
三、实验步骤
1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下：
2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。

3）切胶回收（尽量不要切到不含目的片段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。

4）回收产物电泳检测后进行连接：
连接体系： 10×T4连接Buffer 1μl
目的基因 6μl
质粒载体 2μl
产物酶切体系
pPI9K 质粒酶切体系 DDW
4.6μl DDW 7μl 10×H
Buffer
1μl 10×H Buffer 1μl 目的片段
4μl pPI9K 质粒 1.6μl NotI quickcut 0.2μl NotI quickcut 0.2μl
EcoRI quickcut 0.2μl(37℃15min) EcoRI quickcut
0.2μl(37
℃15min)
T4 Ligase 1μl
混合后16℃，过夜连接。

完成后放入4℃冰箱可，备用。

四、注意事项
1、加样次序一般应为：水+缓冲液+DNA+酶。

2、限制性内切酶的量不要过多，最多不超过部体积的1/10，否则易发生酶的星号反应。

所谓酶的星号反应就是指改变酶切条件时酶的识别位点专一性下降，导致酶切图谱混乱的现象。

3、内切酶的选择和使用方案须根据具体的实验情况来精心设计。

4、限制性内切酶和连接酶都极易失活，须在冰盒上操作，同时防止污染。