石斛组织培养研究进展张明1,夏鸿西2,朱利泉2,张玉进2(1.重庆市中药研究院,重庆400065; 2.西南农业大学,重庆400716)[摘要]目的:综述国内外对石斛组织培养进行的深入研究。
方法:系统查阅国内外近10年来的有关文献20余篇。
结果与结论:介绍了石斛组培的多种方法,对培养基、激素及多种条件对组培的影响作了论述,并提出了存在的问题及对策。
石斛属Dendrobium为兰科第2大属,多年生草本植物,全球计有1 500种。
多生于树皮或岩石上,开花多,结果少,每果可含100万粒种子。
种子细如粉尘[1],每粒重约0.3～0.4μg。
种胚不超过球形阶段,即存在后熟现象。
由于缺乏胚乳组织,需与真菌共生(symbiotical)才能萌发,自然条件下发芽率一般不及5%。
石斛为合轴生长(sympodial),分株是其繁殖的主要方式,对生长条件的要求较为苛刻。
石斛属植物中有不少是名贵中药,在《本草纲目》中石斛被列为上品。
我国76种石斛属植物中有近40种作药用[2],著名的有 D.nobile(金钗石斛)、D.candium(铁皮石斛)、D.huosanness(霍山石斛)等。
具有强阴益精、补肾益力、轻生延年等作用,其应用范围正迅速扩大。
石斛属植物约有四分之一可供观赏[3],称为石斛兰 D.orchids,以花艳丽而著称,近年作为观赏植物发展迅速,已形成独立产业。
集药用和观赏于一体的价值,加之过度的采伐利用和繁殖率低,造成了石斛供需之间的紧张状况,我国已将其列为濒于绝灭的受保护的中药品种之一。
自1960年法国人Gmorel利用石斛基尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来,石斛组织培养逐步走向深入化。
近年来,石斛组织培养的最佳条件,包括光照、温度、pH以及如何选用外植体,选用激素等取得长足进展,并利用组培技术研究种子萌发过程中的生理生化变化等,还获得了转基因石斛植株。
我国石斛组织培养研究起步较晚,直到1984年,徐云鹏等才首次报道获得霍山石斛试管苗[4]。
此后又利用铁皮石斛、束花石斛、兜唇石斛的茎尖、叶尖或种胚获得了再生植株。
1石斛组织培养再生植株的获得组织培养获得石斛再生植物株的途径有器官发生型和原球茎发生型两种。
器官发生型通过外植体组织培养,使预先存在的分生组织形成芽(如腋芽)或不定分生组织(如子叶、茎段、愈伤组织等)形成不定芽。
此途径又可分为3种类型:无菌短枝型(又称节培法),芽增殖型,器官发生型;原球茎发生途径通过石斛适宜外植体诱导产生胚性愈伤组织并增殖,随后形成类胚组织原球茎进而发育成完整的再生植株。
通常由种子离体培养产生的胚性组织称原球茎(protocorm),而上外植体叶尖、基尖等诱导形成的胚性组织称为拟原球茎(protocorm like bodies)即PLBs。
原球茎或拟原球茎转入不含任何激素或生长素的培养基(如MS)便可再生出完整小植株。
1.1原球茎发生影响原球茎发生的主要有外植体的大小、来源、生理状态、培养基类型、激素浓度,种类、处理时间及一些其它因素。
1.1.1外植体石斛组培拟原球茎的诱导可以选择花序枝、叶尖、茎节切段等作外植体。
Lam ChanLT等[5]用D.somia的花序枝尖作外植体在VW培养基上诱导PLBs的发生,结果以1～3 mm的外植体形成的PLBs数目最多。
取茎基部的分蘖芽或茎的顶芽作外植体,前者好于后者。
Kim报道取侧芽进行液体培养,在45 d内开始形成拟原球茎。
以种子离体培养形成原球茎的能力与其种龄有关,叶秀鳞[6]取铁皮石斛2～6个月种龄的胚进行离体培养发现,种龄愈长;其胚细胞愈多,萌发形成原球茎的频率就越高,但4,5,6个月种龄的胚差不多。
曾宋君[7]用5种石斛的种子在N6培养基上进行组培得出了相似的结论。
1.1.2培养基选择适宜的培养基对石斛的分化至关重要,常用的培养基为MS,Nitch,Knudso C(KC),N6等。
Devi J等[8]利用D.moschatum 的茎尖在5种培养基上诱导PLBs的发生,结果以Nitch培养基的效果最好;Suman K[9]1991年在KL,VW,MS,W,Nitch,Mitra 6种培养基上进行D.fimbria-tum种子的离体培养,结果发现在Nitch,VW上培养基上萌发率高达91%,其次是MS(85%),在MS,Nitch,VW上培养4～5 d便出现原球茎,其它培养基则出现较迟。
MS培养基上获得的原球茎体积最大,因此作者推断D.fimbriatum的种子萌发及发育需要盐分较高的培养基。
这与周华伟[10]报道的石斛组培的结果相似。
曾宋君[7]以D.candium,D.loddigesi,D.wagii,D.densiflorum,D.fim-briatum5种石斛在MS,KS,SH,VW,KC,改良N6及PT培养基上进行离体培养,得出石斛的最适通用培养基是改良N6或PT培养基附加0.2 mg·L-1的NAA和2%蔗糖。
此外,侧芽和顶芽对培养基的要求也各不相同,VW液体培养基对节生花型石斛效果较好,在4～5周内即可形成PLBs;蝶生花型和常绿类石斛的腋芽用KC固体培养基要比KC液体培养基好,以顶芽作外植体则正相反。
继代和初代培养的培养基可以不同。
石斛的原球茎易分化成苗,故继代培养基以液体振荡培养可获得较佳效果。
1.1.3激素一般高浓度的细胞分裂素有利于诱导芽的发生,而高浓度的2.4-D对愈伤组织的诱导形成有促进作用。
愈伤组织的不规则分裂会导致拟原球基和不定芽的发生,Lan C以花枝尖作外植体在VW 培养基上添加 1 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA或添加 1 mg·L-1Kintin和0.1 mg·L-12.4-D均能获得高比例的PLBs,周月坤[11]在MS培养基上附加0.5 mg·L-16-BA和0.5～2.0 mg·L-12.4-D,由叶基部诱导产生愈伤组织,进而分化出拟原球茎获得完整植株,并指出2.4-D对诱导愈伤组织形成和分化有重要作用,NAA的加入对分化PLBs的有一定的促进作用。
王光远[12]以D.can-dium种子离体培养,在MS上添加0.5 mg·L-1NAA,暗处培养1周后产生大量的愈伤组织,转入光照培养,原球茎大量发生。
外加激素ABA对原球茎的分化也会产生影响,在添加0.5 mg·L-1ABA的MS培养基上预培养15d后转入含2 mg·L-16-BA的MS培养基上培养,150 d后其试管开花率达84.0%,而不用ABA预处理的,其成花率只有27.0%。
如果原球茎继续在含ABA的培养基上培养则不会有培养体花芽的发生。
1.1.4其它影响因素除了外植体、培养基、激素影响外,光照、温度、pH以及外源添加物等也会影响原球茎或PLBs的发生及发育。
石斛组培常用的温度为(26±1)℃,光强 1 600～2 000 lx,日照光8h,pH为5.0～5.5。
当然,在组织培养过程中由于培养体的代谢活跃改变培养基的pH,进而会影响到培养体的生长,Sharon M等[13]在培养D.snowfire原球茎的过程中发现,培养基的pH值在45 d后由5.1降至4.1,培养体变成褐色,但通过反复转入新鲜培养基可防止或消除褐变现象。
石斛组培过程中最常用的添加物是10%～25%的椰乳(CW)。
另据曾宋君[7]的研究,CW可用廉价的香蕉汁,马铃薯汁、蕃茄汁取代。
蔗糖对胚萌发及成苗的效果不及白糖或片糖,在组培过程中加入活性炭是必要的,它可以除去琼脂中的毒性物质或培养物产生的芳香族代谢废物、防止组织褐变,并刺激胚胎的发生与生根。
因石斛的胚性外植体即便在有生长素存在时也较难生根,因此如何使芽生根则是成苗的关键。
1.2器官发生影响3种类型器官发生的因素包括外植体、培养基、激素等。
1.2.1无菌短枝型又称节培法或微型扦插法,即将待繁殖的材料如石斛茎节、花梗、枝等剪成带一叶的单芽茎段,转入成苗培养基中进行培养。
MosichS E等[14]即是通过茎段培养获得完整小植株的,其方法是将石斛的茎段(长度>10 cm)按2∶3∶2切成3段,上段灭菌5～7 min,中段10～15 min,下段20～15 min,灭菌后切去两端变色的组织,再横切成段,下端插入改良Knop培养基,4周后芽开始生长,随后转入MS 培养基即获得石斛再生苗。
1.2.2芽增殖型即通过茎尖或初代培养的芽在适宜的培养基上诱导,不断发生腋芽进而形成丛芽,随后转入生根培养基行生根培养从而获得再生植株。
Sobhana等[15]利用5种石斛D.moschatum,D.fimbriatum,D.nobile,D.crumenatum和D.pierardii腋芽分别以VW,KC,MS,Morel培养基进行离体培养,各培养基均附加 3 mg·L-16-BA和1mg·L-1NAA,诱导芽的增殖,结果以VW产生的芽培养体数目最多。
此外,作者以VW培养基附加BA或KT(浓度分别为1,2,3,4,5,6 mg·L-1)添加或者不添加NAA(1 mg·L-1)进行试验,证实6-BA可以产生最大数量的丛生芽,5种石斛中又以D.moschatum数目最多,D.pierardii添不添加NAA结果相似。
这说明培养基的种类、激素的浓度及种类对不同石斛芽的增殖有很大影响,如果以茎段作外植体,其取向至关重要。
在Nayak Nr等[16]的研究中,D.phylum和D.moschatum茎节切段作水平放置可以获得再生植株,而垂直放置的处理则无任何茎芽的发生。
值得注意的是Nihar Ranjan首次将一种高细胞分裂素活性的物质thidiazuron(TDZ)应用于石斛的组织培养并与6-BA比较作用效果,结果后者比前者更有效。
其最佳作用浓度为2.2～4.5μmol·L-1,提高TDZ的使用浓度会对茎芽的再生产生抑制作用。
TDZ是1种杂环芳香脲,在大豆、小红萝卜的子叶、烟草、金甲豆等组培中广范用于诱导芽的增殖,效果显著[17]。
在组织培养中若加入10.8μmol·L-1的6-BA,诱导生根会比NAA更有效。
其特点是繁殖速度快,是茎尖培养和脱毒菌初期必由之路,而石斛组培中的关键又在于促进生根。
1.2.3不定芽发生型由愈伤组织直接形成不定芽,然后转入生根培养基中可诱导生根而形成完整的小植株。
以石斛的基节,幼嫩小叶、花梗等作外植体均可获得较好的诱导效果。
此外也有由“原球茎”形成愈伤组织的报道。
叶秀鳞观察到由D.candi-um种子离体培养形成的原球茎,转入N6培养基培养时,表面细胞发生不规则分裂,产生大量愈伤组织,随后由愈伤组织分化形成不定芽再发育成幼苗。